(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210560784.8 (22)申请日 2022.05.23 (71)申请人 四川省原子能研究院 地址 610100 四川省成 都市龙泉驿区驿都 西路4128号 (72)发明人 王艳　高鹏　陈谦　何江　徐攀　 黄敏　伏毅　陈浩　吴舸洋　 邱娅璐　 (74)专利代理 机构 成都天嘉专利事务所(普通 合伙) 5121 1 专利代理师 赵丽 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于籼稻热胁迫下基因表达量分析的实时 荧光定量PCR的内参基因及其构建方法 (57)摘要 本发明公开了一种用于籼稻热胁迫下基因 表达量分析的实时荧光定量PCR的内参基因及其 构建方法， 属于植物基因工程技术领域。 本发明 的3个内参基因的核苷酸序列如序列表SEQ  ID  NO.1‑10所示； 对II优838及其亲本高温胁迫后的 剑叶进行转录组高通量测序； 从测序结果中选5 个候选内参基因， 在水稻cDNA模板 上进行荧光定 量PCR扩增， 根据候选基因在不同水稻样品中的 表达量差异情况， 筛选到最合适的内参基因； 采 用筛选的3个内参基因一同对目的基因的表达量 进行校正和标准化， 能够更准确的检测籼稻基因 的表达变化， 保证荧光定量PCR的灵敏度和准确 性； 用热胁迫响应基因进行方法验证， 发现每个 基因在籼稻样品中的相对定量表达量值， 与测序 结果的RPKM值和TPM值的吻合度都很好。 权利要求书1页 说明书12页 序列表4页 附图4页 CN 114807423 A 2022.07.29 CN 114807423 A 1.一种由LOC_Os03g50885.1、 LOC_Os0 1g12800.1和LOC_Os02g16709.1三个基因作为籼 稻热胁迫下基因表达量分析 的实时荧光定量PCR的内参基因的应用， 其核苷酸序列分别如 序列表SEQ  ID NO.1‑3所示。 2.根据权利要求1所述的三个基因作为籼稻 热胁迫下基因表达量分析的实时荧光定量 PCR的内参基因的应用， 其特征在于： 用于扩增LOC_ Os03g50885.1的正向引物序列如序列表 SEQ ID NO.6所示， 反向引物序列如序列表SEQ  ID NO.7所示； 用于扩增LOC_Os01g12800.1 的正向引物序列如序列表SEQ  ID NO.8所示， 反向引物序列如序列表SEQ  ID NO.9所示； 用 于扩增LOC_Os02g16 709.1的正向引物序列如序列表SEQ  ID NO.10所示， 反向引物序列如序 列表SEQ ID NO.11所示。 3.一种用于籼稻热胁迫下基因表达量分析的实时荧光定量PCR的内参基因的构建方 法， 其特征在于： 包括如下步骤： （1） 将父本辐恢838， 母本II ‑32A和子代II优838水稻进行高温胁迫处理后， 对II优838 开花期的剑叶进行转录组高通量测序， 并对II优838及其亲本开花期的剑叶进行数字表达 谱测序， 从5个转录组测序和12个DGE测序结果中选择出表达稳定的两个内参基因， 其核苷 酸序列如序列表SEQ  ID NO.2、 SEQ  ID NO.3所示， 同时选用在水稻属中常用的3个传统内参 基因作为对比参照组， 其核苷酸序列如序列表SEQ  ID NO.1、 SEQ  ID NO.4、 SEQ  ID NO.5所 示， 共5个候选内参基因； （2） 将上述5个候选内参基因进行引物设计， 对每个反转录生成的水稻cDNA进行荧光定 量PCR反应， 对获得的数据采用Bio ‑Rad CFX Manager 3.0软件进行内参基因稳定性评估分 析， 通过5个候选内参基因的M值来筛选最佳的内参基因， 表达量值差异越小， 基因表达越稳 定， 最终筛 选得到高温胁迫处 理下最合适的内参基因和内参基因数； （3） 通过使用水稻中的热胁迫响应基因进行验证， 设计每个热胁迫响应基因的荧光定 量PCR引物， 对反转录生成的水稻cDNA模板进行荧光定量PCR反应， 用Bio ‑Rad CFX Manager  3.0软件分析数据， 采用Pfaffl算法在LOC_Os03g50885.1、 LOC_Os01g12800.1和LOC_ Os02g16709.1三个内参基因的共同标定下得到每个水稻样 品的热胁迫响应基因的相对定 量表达量 值， 与高通 量测序结果的RPKM值和TPM值相互对比验证。 4.根据权利要求3所述的一种用于籼稻热胁迫下基因表达量分析的实时荧光定量PCR 的内参基因的构建方法， 其特征在于： 所述荧光定量PCR反应是将各样 本反转录生 成的cDNA 第一条链作为模板， 荧光定量PCR反应体系 为10 μL， 在冰上进行反应液配制， 各试剂的体积 为： 5μL 5×SYBR  ®Premix Ex TaqII， 2 μL cDNA模版， 0.5μL  PCR Forward Primer 10μM， 0.5 μL PCR Reverse Primer 10 μM， 最后加入2 μL  ddH2O到10 μL体积， 实验重复3次。 5.根据权利要求3或4所述的一种用于籼稻热胁迫下基因表达量分析的实时荧光定量 PCR的内参基因的构建方法， 其特 征在于： 所述 荧光定量PCR  反应条件为： A、 预变性95℃， 3mi n； B、 循环扩增 （40个 循环） ： 变性95℃， 5  s； 退火和延伸6 0℃， 30 s， 每个循环结束后采集 荧光信号数据； C、 绘制扩增产物熔解曲线： 以5s增长 0.5摄氏度的速度从6 5℃到95℃间变温。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807423 A 2用于籼稻热胁迫下基因表达量分析的实时荧光定量PCR的内 参基因及其构建 方法 技术领域 [0001]本发明属于植物基因工程技术领域， 具体涉及一种用于籼稻热胁迫下基 因表达量 分析的实时荧 光定量PCR的内参基因及其构建方法。 背景技术 [0002]实时荧光定量PCR （Quantitative  Real‑time PCR） 是指在PCR反应体系中加 入荧 光基团， 在DNA扩增反应中利用荧光信号积累， 能实时监测出每次聚合酶链 式反应 （PCR） 循 环后的产物增加总量。 由于在PCR扩增的指数时期， 模板的Ct值 （Cycle  threshold， Ct值： 每 个反应管内的荧光信号到达 设定阈值时所经历的循环数） 和该模板的起始拷贝数存在线性 关系， 所以成为定量的依据， 能通过荧光信号对PCR进程进行实时检测。 其中， 我们采用的 SYBR GreenⅠ法是在PCR反应体系中， 加入过量SYBR荧光染料， SYBR荧光染料特异性地掺入 DNA双链后， 发射荧光信号， 而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号， 从而保 证荧光信号的增加与PCR产物的增加 完全同步。 SYBR仅与双链DNA进行结合， 因此可以通过 熔点曲线， 确定PCR反应是否特异。 [0003]实时荧光定量PCR  技术由美国Applied  Biosystems公司在1996  年发明， 该技术 实现了PCR  从定性到定量的飞跃， 而且具有灵敏性高、 特异性强、 快速准确等特点。 实时荧 光定量PCR 是一种强有力的检测基因表达谱的方法， 可以分析基因在不同时期的表达差异 以及经过不同处理的样 本间基因的表达差异 等等。 在RT ‑qPCR实验中， 内参基因被用来作为 数据标准化的对照， 以校正作为模板的cDNA所存在的数量差异 （Guierez  et al.2008,   Huggett et al.2005， Vandesopmpeleetal.2 002） 。 好的内参基因应该在不同实验条件下或 不同时间点上， 在各个样品中的表达都无改变。 某些基因如GAPDH,  β‑actin 或rRNA通常被 用作内参基因。 但有大量的研究显示， 这些基因在不同组织或不同处理条件下 的表达都有 不同， 在这种情况下这些基因可能并不适合被用作内参基因。 因此内参基因需要通过实验 数据进行仔细的筛 选： 1.在每个实验条件下或时间点下取至少一个或两个样品进行总RNA抽提， 以便确 定其纯度和质量 （我的实验中有48个样本） 。 [0004]2.标准化样品浓度后以相同体积对每 个样品进行反转录 （48个cDNA） 。 [0005]3.以每个cDNA样品为模板， 取同样体积进行qPCR 实验。 [0006]4.比较不同条件下每 个基因的Cq值。 [0007]不同条件或时间点下的Cq差异( △Cq)应不超过0.5 。 [0008]因为任一特定的基因都可能受不同实验条件影响， 则在实验中同时检测至少三个 或四个位于不同代谢途径中的特定内参基因， 并对表达差异 最小的几个基因进行几何平均 以准确地标准 化数据 （Vandesormpele etal 2002） 。 [0009]籼稻的耐热性优于粳稻， 在籼稻资源中进行耐热性筛选将有更大的机会获得强耐 热性的稻种资源。 不育系籼稻II ‑32A与恢复系辐恢838经传 统杂交育种方法培育成功的中说　明　书 1/12 页 3 CN 114807423 A 3