(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210564184.9 (22)申请日 2022.05.23 (71)申请人 赣南师范大学 地址 341000 江西省赣州市 蓉江新区师 大 南路 (72)发明人 黄爱军　王莹　易龙　周俊　 (74)专利代理 机构 西安铭泽知识产权代理事务 所(普通合伙) 61223 专利代理师 崔瑞迎 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于柑橘褪 绿矮缩病毒的LAMP检测引物、 其 应用及检测方法 (57)摘要 本发明属于病毒检测技术领域， 具体涉及用 于柑橘褪绿矮缩病毒的LAMP检测引物、 其应用及 检测方法。 该引物能特异性地扩增出柑橘褪绿矮 缩病毒的CP基因， 所述引物包括外引物F3/B3、 环 引物LF/LB及 内引物FIP/BIP， 核苷酸序列如SEQ   ID NO.18‑23所示。 本发明基于该引物建立了 LAMP检测方法， 该方法灵 敏度高、 特异性强， 操作 简单快速， 能够用于柑橘褪 绿矮缩病毒的快速检 测。 权利要求书1页 说明书5页 序列表4页 附图4页 CN 115044707 A 2022.09.13 CN 115044707 A 1.用于柑橘褪绿矮缩病毒的LAMP检测引物， 其特征在于， 该引物能特异性地扩增出柑 橘褪绿矮缩病毒的CP基因， 所述引物包括外引物F3/B3、 环引物LF/LB及内引物FIP/BIP， 核 苷酸序列依次如SEQ  ID NO.18‑23所示。 2.权利要求1所述的引物在制备柑橘褪绿 矮缩病毒检测试剂盒中的应用。 3.一种柑橘褪绿 矮缩病毒的LAMP检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1、 提取样品总DNA； S2、 以所述总DNA为模板， 利用权利要求1所述的引物进行LAMP扩增； S3、 向扩增产物中加入荧光染料SYBR  Green I溶液， 轻弹混匀后观察颜色变化， 若荧光 为绿色， 则样品中含有柑橘褪绿矮缩病毒， 若荧光为橘黄 色， 则样品中不含柑橘褪绿矮缩病 毒。 4.根据权利要求3所述的一种柑橘褪绿矮缩病毒 的LAMP检测方法， 其特征在于， S2中， LAMP扩增反应 体系为： 引物混合液5.6 μL； 10×Isothermal  amplification buffer 2.5 μL； 100mM MgSO4溶液1.5 μL； 10mM each的dNTP溶 液3.5 μL； 5mol·L‑1的甜菜碱溶 液4.0 μL； 8000units/mL Bst 2.0DNA聚合酶0.7 μL； DNA模板1.0 μL； 双蒸水补足25 μL。 5.根据权利要求4所述的一种柑橘褪绿矮缩病毒 的LAMP检测方法， 其特征在于， S2中， 引物混合液的组成为： 10p mol·μL‑1的外引物F3 /B3溶液， 各0.4 μL； 20p mol·μL‑1的环引物LF/LB溶 液， 各0.8 μL； 20p mol·μL‑1的内引物FIP/BIP溶 液， 各1.6 μL。 6.根据权利要求5所述的一种柑橘褪绿矮缩病毒 的LAMP检测方法， 其特征在于， S2中， LAMP扩增反应程序为67℃， 3 0min。 7.根据权利要求6所述的一种柑橘褪绿矮缩病毒 的LAMP检测方法， 其特征在于， S3中， 向扩增产物中加入1.0 μL的5 0倍稀释的荧 光染料SYBR  Green I。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115044707 A 2用于柑橘褪 绿矮缩病毒 的LAMP检测引物、 其应用及检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于病毒检测技术领域， 具体涉及用于柑橘褪绿矮缩病毒的LAMP检测引 物、 其应用及检测方法。 背景技术 [0002]柑橘是一种重要经济作物， 是仅次于小麦和玉米 的世界第三大贸易农产品。 有包 括中国、 美国、 巴西等在内的150多个国家和地区种植。 我国是柑橘主要的原产地之一， 种质 资源丰富， 产量和面积均居世界第一， 有10多个省市区栽种柑橘， 已成为促进我国新农村 建 设的重要支 柱产业。 [0003]病毒病是柑橘生产过程中重要限制性因素之一。 柑橘褪绿矮缩病是由柑橘褪绿矮 缩病毒(Citrus  chlorotic  dwarf‑associated  virus,CCDaV)引起的一种重要的病毒病 害， 可通过接穗和嫁接传播， 能侵染多数的柑橘品种， 引起植株叶片变形、 扭曲、 花叶等症 状， 造成果实产量和质量的双重下降， 严重时植株活力丧失。 [0004]病毒的快速检测技术对于病害防控具有重要意义。 聚合酶链式反应(Polymerase   chain reaction,PCR)是病毒检测中应用最广泛的技术之一。 目前针对CCDaV已建立了常规 PCR、 实时荧 光。 [0005]定量PCR和环介导恒温扩增(Loop ‑mediated  isothermal  amplification， LAMP) 等检测方法， 其中实时荧光定量P CR和LAMP具有较高的检测灵敏度， 可检测的最小总核酸浓 度为5.2×10‑6μg·μL‑1， 较普通PCR方法灵敏度高100倍。 PCR检测方法检测结果可重复性 好， 检测灵敏度高， 检测特异性好， 但是其检测过程对于检测设备要求较高， 需要精确控温 且可变温的PCR仪， 完成扩增后的产物片段分离的电泳仪及最后观察试验结果的凝胶成像 仪。 因此， 该方法一般应用于实验室病原检测， 难以被基层检测部门应用或被用于病原的即 时检测。 LAMP检测方法是日本学者Notomi在2000年建立的一种新型分子检测技术。 该技术 在扩增过程中需加入2～3对引物， 增加了扩增的特异 性。 且整个扩增过程在恒温 中进行， 降 低了对扩增仪器的需求， 扩增速度较P CR过程更快， 扩增结果的呈现可通过在 扩增产物中加 入荧光染料后， 直接肉眼观察。 这些优点使得LAMP较PCR技 术具有更高的应用前 景。 [0006]申请号为201510330728.5的中国专利公开了一种柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP 检测方法， 其引物虽然能够实现柑桔褪绿矮化相关病毒目的基因的特异性扩增， 但是其选 取的目的基因及设计的引物使环介导恒温扩增反应时间较长， 影响检测的效率。 发明内容 [0007]为弥补现有技术的不足， 本发明提供了用于柑橘褪绿矮缩病毒的LAMP检测引物、 其应用及检测方法。 [0008]第一方面， 本发明提供用于柑橘褪绿矮缩病毒的LAMP检测引物， 该引物能特异性 地扩增出柑橘褪绿矮缩病毒的CP基因， 所述引物包括外引物F3/B3、 环引物LF/LB及内引物 FIP/BIP， 核苷酸序列依次如SEQ  ID NO.18‑23所示。说　明　书 1/5 页 3 CN 115044707 A 3