(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210563028.0 (22)申请日 2022.05.23 (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大 道1800号 (72)发明人 段诺　李昌鑫　吴世嘉　宋铭倩　 王周平　 (74)专利代理 机构 苏州市中南伟业知识产权代 理事务所(普通 合伙) 32257 专利代理师 王玉仙 (51)Int.Cl. C12N 15/115(2010.01) C40B 50/06(2006.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12Q 1/6876(2018.01) (54)发明名称 特异性识别左旋咪唑的核酸适配体及其双 模式纳米 探针和应用 (57)摘要 本发明涉及一种特异性识别左旋咪唑的核 酸适配体及其双模式纳米探针和应用， 核酸适配 体的核苷酸序列为SEQ  ID NO.1‑3所示之一， 对 左旋咪唑具有高特异性和亲和力， 并基于该核酸 适配体开发了一种双模式纳米探针， 包括核酸适 配体、 互补链、 AuNPs/Cu ‑TCPP(Fe)或AuNPs/Co ‑ TCPP(Fe)纳米片， 在左旋 咪唑检测中表现良好， 具有高灵敏度和准确度。 权利要求书1页 说明书9页 序列表2页 附图5页 CN 115044587 A 2022.09.13 CN 115044587 A 1.一种特异性识别左旋咪唑的核酸适配体， 其特征在于： 所述核酸适配体的核苷酸序 列为SEQ ID NO.1‑3所示之一。 2.根据权利要求1所述的核酸适配体， 其特征在于： 所述核酸适配体的3 ′端或5′端修饰 有功能基团或分子 。 3.根据权利要求2所述的核酸适配体， 其特征在于： 所述功能基团或分子为同位素、 电 化学标记物、 酶标记 物、 荧光基团、 生物素、 亲和配 基或巯基。 4.根据权利要求1所述的核酸适配体， 其特征在于， 所述核酸适配体的筛选方法包括以 下步骤： 构建初始文库及S EQ ID NO.4‑5所示核苷 酸序列的引物对， 进行亲和力筛选和特异 性筛选， 得到所述特异性识别 左旋咪唑的核酸 适配体； 所述初始文库的序列在结构上符合下述通式所示的结构特征： 5 ′ ‑AATCAAACGCTAAGG ‑ N10‑GTGCACCCATTCTTG ‑N30‑AAGCTTGGTACCCGTATCGT ‑3′， 其中N代表碱基A、 T、 C、 G中的任一 个， N10代表随机片段长度为10个碱基， N30代表随机片段长度为3 0个碱基。 5.一种基于左旋咪唑适配体的双模式纳米探针， 其特征在于： 所述双模式纳米探针包 括权利要求1 ‑4任一项所述的核酸适配体、 互补链和纳米片， 所述纳米片为AuNPs/Cu ‑TCPP (Fe)纳米片或AuNPs/ Co‑TCPP(Fe)纳米片； 所述核酸适配体通过磁珠进行固定， 所述互补链与核酸适配体部分互补， 互补链5 ′端 或3′端修饰巯基且通过Au ‑S共价键与纳米片连接 。 6.根据权利要求5所述的双模式纳米探针， 其特征在于： 所述AuNPs/Cu ‑TCPP(Fe)纳米 片或AuNPs/Co ‑TCPP(Fe)纳米片由金纳米粒子负载于卟啉金属有机框架Cu ‑TCPP(Fe)或Co ‑ TCPP(Fe)上得到。 7.根据权利要求5所述的双模式纳米探针， 其特征在于： 所述核酸适配体通过生物素、 亲和素与磁珠 连接。 8.根据权利要求5所述的双模式纳米探针， 其特征在于： 所述互补链的核苷酸序列如 SEQ ID NO.6所示。 9.权利要求5 ‑8任一项所述的双模式纳米探针的制备方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： (1)将氯金酸与Cu ‑TCPP(Fe)或Co ‑TCPP(Fe)混合， 在还原剂存在的条件下制备得到所 述纳米片； (2)将巯基修饰的互补链与所述纳米片孵 育， 得到互补链/纳米片； (3)将所述互补链/纳米片与磁珠固定的核酸 适配体孵育， 得到所述双模式纳米探针。 10.权利要求1 ‑4任一项所述的核酸适配体或权利要求5 ‑8任一项所述的双模式纳米探 针在检测左旋咪唑中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115044587 A 2特异性识别左旋咪唑的核酸适配体及其双模式纳米探针和 应用 技术领域 [0001]本发明涉及 生物技术领域， 尤其涉及一种特异性识别左旋咪唑的核酸适配体及其 双模式纳米探针和应用。 背景技术 [0002]驱虫药用于预防或治疗影响体重增加的寄生虫感染。 目前， 驱虫药已广泛用于人 类和兽医学以控制寄生虫侵扰。 其中一种药物左旋咪唑已获准用于治疗包括家 禽在内的各 种动物的体内寄生虫感染。 左旋咪唑主要用于治疗传染性寄生虫病， 是一种合成的高效低 毒的广谱驱虫药。 其抗虫治疗效果显著， 药源充足， 应用历史悠久且性质稳定， 对牛、 羊、 猪、 家禽等多种动物的胃肠道线虫和肺线虫有良好的驱虫活性， 广泛用于兽医实践。 其驱虫机 理为抑制延胡索酸还原酶活性， 干扰能量代谢和充当 乙酰胆碱激动剂， 麻痹虫体。 此外， 左 旋咪唑在寄生虫神经系统中充当 乙酰胆碱激动剂， 导致线虫肌肉的去极化， 发生持续性收 缩而致麻痹， 使虫体不能附着于肠壁， 寄生虫随之排出体外 。 [0003]由于左旋咪唑具有良好的驱虫作用和免疫调节功能， 受到畜牧养殖企业的青睐， 在我国动物养殖业中有着广泛的应用。 为确保食品安全， 我国、 美 国、 欧盟和日本等许多国 家或国际组织都针对动物源性左旋咪唑的含量制定了严格的限量标准， 一般为10 ‑100 μg/ kg。 不合理地使用左旋咪唑或不遵守停药期， 动物组织左旋咪唑含量可能超过规定的最大 残留限量 值， 随食物 链间接被人体 摄入， 最终对消费者身体健康造成不良影响。 [0004]当前左旋咪唑的测定方法以色谱法为主， 也会使用与不同检测器相结合的色谱技 术。 包括气相色谱法(GC ‑MS)、 液相色谱(LC ‑UV、 LC‑MS、 LC‑MS/MS)、 高效液相色谱(HPLC、 RP‑HPLC、 HPLC ‑UV、 HPLC‑MS)等。 色谱法定性准确， 但需要色谱级的有机试剂作流动相， 运行 成本较高且废液容易造成环境污染， 需要昂贵的设备或复杂的预处理及专业技术人员操 作， 实际应用范围较窄。 适配体是一种以指数富集配体系统进化(SELEX)技术 从寡核苷酸文 库中经体外筛选得到的高亲和力特异性结合靶 标的单链寡核苷 酸分子(ssDNA或RNA)， 通常 由20‑100个碱基组成， 能与靶标特异 性结合， 被称为 “化学抗体 ”。 靶物质能够诱导适配体由 自由构象折叠成G ‑ 四链体、 发夹、 假结等三 维空间结构， 与适配体特定位点通过氢键、 疏水 作用力、 范德华力等与适配体发生非共价结合。 高亲和性高特异性适配体序列的获得是适 配体技术的核心。 S ELEX技术是目前最常用的适配体筛选手段。 与大多 数需要将靶标固定在 固相介质上的SELEX方法相比， Capture ‑SELEX 的主要优势是将DNA文库而不是靶 标固定在 固相介质上， 能够针对无法固定的小分子靶标的适配体筛选， 保持了靶标的原始结构 。 目前 适配体在兽药残留检测中已有一定的应用， 但尚未有关于左旋咪唑特异 性适配体筛选研究 的报道。 基于此， 开发一种灵敏、 高效、 简便针对左旋咪唑残留的适配体检测新技术具有非 常重要的意 义。说　明　书 1/9 页 3 CN 115044587 A 3