(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210544741.0 (22)申请日 2022.05.19 (71)申请人 南京农业大 学 地址 210095 江苏省南京市玄武区卫岗1号 (72)发明人 鲍永美　宋其升　王玮　张红生　 黄骥　王建飞　余耀　唐海娟　 董世楠　张成成　 (74)专利代理 机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 专利代理师 傅婷婷　徐冬涛 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 水稻种子中稻瘟病菌RPA快速检测方法及应 用 (57)摘要 本发明属于作物分子遗传育种学领域， 公开 了水稻种子中稻瘟病菌的RPA快速检测方法及应 用， 包括如下步骤： (1)取水稻种子样品， 提取水 稻种子样品基因组DNA。 (2)利用一组引物， 对水 稻种子样品基因组DNA进行重组酶聚合酶扩增。 通过琼脂糖凝胶电泳观察是否有扩增的目标条 带来判断样品中是否含有稻瘟病菌。 通过本发明 提供的方法可以快速准确的诊断出水稻种子中 是否含有稻瘟病菌， 有利于防治稻瘟病， 减少经 济损失。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图3页 CN 114959094 A 2022.08.30 CN 114959094 A 1.用于水稻种子中稻瘟病菌检测的RPA引物组合物， 其特 征在于选自以下任意 一组: 第一组由SEQ  ID NO.1所示的引物FI， SEQ  ID NO.2所示的引物RI组成； 第二组由SEQ  ID NO.3所示的引物FI I， SEQ ID NO.4所示的引物RI I组成。 2.权利要求1所述的RPA引物组合物在检测水稻种子中稻瘟病菌中的应用。 3.权利要求1所述的RPA引物组合物在制备检测水稻种子中稻瘟病菌的试剂中的应用。 4.一种检测水稻种子 中稻瘟病菌的RPA快速检测试剂盒， 其特征在于包含权利要求1所 述的RPA引物组合物。 5.水稻种子中稻瘟病菌的RPA快速检测方法， 其特 征在于如下步骤： (1)取水稻种子样品， 提取 水稻种子样品基因 组DNA； (2)利用权利要求1所述的RPA引物组合物对所述的水稻种子样品基因组DNA扩增后进 行琼脂糖凝胶电泳检测， 如果有扩增的目标条带， 则在水稻种子中检测到了水稻稻瘟病菌； 如果无扩增的目标 条带， 则种子中不带有水稻 稻瘟病菌 。 6.根据权利要求5所述的RPA快速检测方法， 其特征在于RPA反应的体系为： 体积为50μ L， 其中水化缓冲液29.4 μL， 上下游引物F/R各2 μL， 再加入9.1 μL  ddH2O和5.0 μL核酸模板， 最 后加入2.5 μL醋酸镁并充分混匀。 反应条件为： 密闭条件下， 39℃恒温扩增20min。 反应结束 后， 加入50 μL酚/氯仿1:1抽提反应液， 12000r ·min‑1离心5min， 取5 μL上清液进行电泳检测， 每个反应重复3次。 7.根据权利 要求5所述的RPA快速检测方法， 其特征在于反应条件为： 密闭条件下， 39℃ 恒温扩增20mi n。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114959094 A 2水稻种子中稻瘟病菌R PA快速检测方 法及应用 技术领域 [0001]本发明属于农作物分子遗传育种学领域， 涉及水稻种子中稻瘟病菌RPA快速检测 方法及应用。 背景技术 [0002]水稻作为我国重要粮食作物之一， 在保证国家粮食安全方面有着重大的意义。 水 稻生长过程中常常遭受稻瘟病(Rice  blast)的危害， 而稻瘟病菌(Magnaporthe  oryzae, M.oryzae)作为水稻稻瘟病发生的病原菌， 对 水稻的生长发育产生了严重危害。 播种带菌水 稻种子往往造成苗瘟， 使 水稻秧苗产生病斑甚至枯死。 对水稻种子中的稻瘟病菌进 行检测， 可以提前采取 预防措施， 减少稻瘟病的发生， 对水稻生产有重要意 义。 [0003]RPA是一种快速灵敏的新型核酸恒温扩增技术， 能在37 ‑42℃之间进行反应， 10 ‑ 20min内获得可检出水平的扩增产物。 此外RPA体系较为稳定， 可直接利用粗提取的核酸样 本进行扩增， 因此为了建立简便快速的稻瘟病菌检测法， RPA是一个比较好的选择。 因为其 极高的特异 性和灵敏度且反应在恒温下发生的特性， 重组酶聚合酶扩增检测技术已被广泛 运用于病原 物检测领域。 发明内容 [0004]本发明的目的是： 基于RPA技术建立一种快速检测水稻种子中稻瘟病菌的方法， 并 采用NaOH溶液粗提法对 水稻种子中稻瘟病菌进 行核酸提取， 为农业生产上提供一种方便快 捷、 安全可靠的检测技 术。 [0005]本发明的目的可通过如下技 术方案实现： [0006]用于水稻种子中稻瘟病菌检测的RPA引物组合物， 其特 征在于选自以下任意 一组: [0007]第一组由SEQ  ID NO.1所示的引物FI， SEQ  ID NO.2所示的引物RI组成； [0008]第二组由SEQ  ID NO.3所示的引物FI I， SEQ ID NO.4所示的引物RI I组成。 [0009]本发明所述的RPA引物组合物在检测水稻种子稻瘟病菌中的应用。 [0010]一种检测水稻种子稻 瘟病菌的RPA 快速检测试剂盒， 包含本 发明所述的RPA引物组 合物。 RPA技 术(重组酶聚合酶扩增检测技 术)检测水稻种传稻瘟病菌， 包 含如下操作步骤： [0011](1)取水稻种子样品， 采用NaOH溶液粗提法提取水稻样品基因组DNA。 取0.2g待测 水稻种子置于含有小钢珠的2ml试管中， 液氮速冻磨碎好后加入1000 μL的0.5M  NaOH(0.5M   NaOH， 10mM  Na2EDTA)裂解液， 上下轻微摇晃 混匀， 并在室温条件下静置4min。 取上层较清的 研磨提取液， 用TE缓冲液(10mM  Tris， pH8.0， 1mM  EDTA)进行1:30倍数的稀释。 取5.0 μL稀释 液直接用于RPA扩增。 [0012](2)以水稻稻瘟病菌XM_003710175基因中种内保守、 种间特异的一段序列为靶标 设计引物(图2)， 并且这段DNA序列从未被用于稻瘟病菌的检测， 针对这段DNA序列设计了多 组RPA引物， 经过大量的筛选工作， 剔除了那些扩增效果不好、 稳定性差的引物， 最 终留下了 两组RPA引物， 如表1所示。说　明　书 1/4 页 3 CN 114959094 A 3