(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210536550.X (22)申请日 2022.05.17 (66)本国优先权数据 202111470170.2 2021.12.0 3 CN (71)申请人 中国人民解 放军陆军 军医大学 地址 400038 重庆市沙坪坝区高滩岩正 街 30号 (72)发明人 李晋涛　丁晓艳　何久香　周伃欣　 周晓杨　 (74)专利代理 机构 北京海虹嘉诚知识产权代理 有限公司 1 1129 专利代理师 胡博文 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 用于检测非洲猪瘟病毒的引物、 试剂盒及方 法 (57)摘要 本发明涉及病毒检测技术领域， 具体涉及一 种用于检测非洲猪瘟病毒的引物、 试剂盒及方 法。 本发明提供的用于检测非洲猪瘟病毒VP72 基 因的引物， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO:6和SEQ   ID NO:7所示。 提供的试剂盒包 括所述引物。 提供 的方法使用所述引物或所述试剂盒对待测样品 的基因组DNA进行 染料法荧光定量PCR。 该方法特 异性强、 灵敏度高、 重复性好， 并且成本低于 TaqMan探 针法。 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图9页 CN 114807444 A 2022.07.29 CN 114807444 A 1.用于检测非洲猪瘟病毒VP72基因的引物， 其特征在于， 所述引物的核苷酸序列如SEQ   ID NO:6和SEQ  ID NO:7所示。 2.用于检测非洲猪瘟病毒VP72基因的试剂 盒， 其特征在于， 包括权利要求1所述的用于 检测非洲猪瘟病毒VP72基因的引物。 3.根据权利要求2所述的试剂盒， 其特 征在于， 还 包括阳性对照品和/或阴性对照品。 4.根据权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 所述阳性对照品为包含部分或全部VP72 基因的标准质粒； 所述阴性对照品为用于稀释所述阳性对照品的液体。 5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述标准质粒包含SEQ  ID NO:1所示的 核苷酸序列。 6.根据权利要 求5所述的试剂盒， 其特征在于， 所述阳性对照品为浓度为1 ×102copies/ μL的标准质粒 溶液。 7.根据权利要求2 ‑6任一所述的试剂盒， 其特征在于， 还包括PCR预混液； 所述PCR预混 液包含Taq酶、 dNTP混合物、 TB  Green染料以及缓冲液。 8.非洲猪瘟病毒VP72基因的荧光定量PCR检测方法， 其特征在于， 包括使用权利要求1 所述的引物或权利要求2 ‑7任一所述的试剂盒对待测样品的基因组DNA进行染料法荧光定 量PCR。 9.根据权利 要求8所述的方法， 其特征在于， 所述荧光定量PCR的反应体系为： TB  Green  Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×)5 μL， 上游引物(10 μM)0.3 μL， 下游引物(10 μM) 0.3 μL， DNA模板1 μL， 无核酸酶的d dH2O 3.4 μL。 10.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述荧光定量PCR的反应条件为： 预变性 95℃30s； 变性95℃5s， 退火延伸6 0℃30s， 40个循环。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807444 A 2用于检测非洲猪瘟病毒 的引物、 试剂盒及方 法 技术领域 [0001]本发明涉及病毒检测技术领域， 具体涉及一种用于检测非洲猪瘟病毒的引 物、 试 剂盒及方法。 背景技术 [0002]非洲猪瘟病毒(afr ican swine fever virus,ASFV)是双链DNA病毒， 包含外膜、 衣 壳、 双层内膜、 核心壳层和基因组5层结构， 具有3万余个蛋 白亚基(Wang  et al.,2019)， 主 要在髓系细胞中复制， 特别 是抗原呈递细胞(APCs)， 如单核/巨噬细胞和树突状细胞， 引起 组织的严重坏死、 出血， 最终导致死亡(Malmquist&Hay,1960； War dley&Wilkinson,1977； Mebus,198 8； Tulman&Rock,20 01； Sánchez‑Cordón et al.,2018)。 [0003]由该病毒引起的非洲猪瘟(ASF)最早在1921年于非洲肯尼亚国家发生， 1957年传 入欧洲， 1971年传 入美洲， 随后自1982年起 成为地中海撒丁岛地方流行性疾病， 到2007年该 疾病传入了东欧部分国家(S ánchez‑Cordón et al.,2018)； 2018年传入中国(Zhao  et  al.,2019)， 席卷欧、 美、 亚、 非四大洲， 估计造成全球20亿美元的经济损失。 该病发病急， 传 染速度快， 发病率和死亡率均可达到100％， 目前尚无有效疫苗。 一旦确诊感染， 动物 立刻采 取全扑杀措施以防范非洲猪瘟病毒的进一步扩散和蔓延。 因此， 非洲猪瘟病毒的快速和可 靠的检测是至关重要的紧急控制措施。 [0004]在ASFV早期诊断中， PCR方法占主导地位。 2016年， Luo等人通过对35个非洲猪瘟病 毒毒株来源的vp72基因编码序列进行比对， 成功设计了一对具有高度敏感性和通用性的 PCR引物， 建立了一种改良的传统PCR的检测方法(Luo  et al.,2016)。 但该方法费时、 易污 染、 后需电泳检测。 荧光定量PCR将荧光检测和传统PCR结合起来， 具有操作简单、 敏感性高、 特异性强、 重复性好等优点。 荧光定量PCR法有SYB R Green染料法和T aqMan探针法两种， 相 对而言， SYBR  Green染料法因不用合 成带荧光基团的探针， 更为经济实惠， 其特异 性主要依 靠优选的引物对； 而TaqMan探针法， 因需要合成特异性探针， 其成本更高， 但特异性较SYBR   Green染料法好。 世界动物 卫生组织(OIE)制定的ASFV诊断标准中采用的是基于非洲猪瘟病 毒vp72基因建立的qPCR方法， 其利用了兼并引物， 特异性较差(任名等,2020)。 张泉等基于 vp72基因建立了TaqMan探针 法荧光定量PCR检测， 其灵敏度达2 0copies/ μL(张泉等,2 007)。 任名等以及李洪利 等基于vp72基因建立的TaqMan探针法荧光定量PCR检测ASFV方法， 最低 能检测到10copies/ μL， 与OIE引物的扩增灵敏度相当(任名等， 2020和李洪利等， 2012)。 因 此， 需要建立 一种兼顾灵敏度、 特异性和成本的非洲猪瘟病毒分子检测方法。 发明内容 [0005]为建立一种经济快速、 准确灵敏的非洲猪瘟病毒分子检测方法， 我们对30个非洲 猪瘟病毒毒株来源的vp72基因进 行了多重序列比对， 从其保守区域设计和筛选了特异 性引 物， 通过优化反应体系和反应条件， 成功建立了基于非洲猪瘟病毒vp72基因的荧光染料 qPCR方法。 该方法可检测到10copies/ μL的非洲猪瘟病毒阳性质粒标准品， 且特异性强， 重说　明　书 1/8 页 3 CN 114807444 A 3