(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210499537.1 (22)申请日 2022.05.09 (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大 道1800号 (72)发明人 王周平　潘柯文　顾千辉　杨宁茹　 尚滋萱　贺逸菲　马鹏飞　 (74)专利代理 机构 苏州市中南伟业知识产权代 理事务所(普通 合伙) 32257 专利代理师 王玉仙 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/67(2006.01)C12R 1/685(2006.01) C12R 1/66(2006.01) C12R 1/77(2006.01) C12R 1/80(2006.01) (54)发明名称 一种基于金纳米簇的比率荧光生物传感器 及其制备方法与其在检测曲霉属霉 菌中的应用 (57)摘要 本发明涉及一种基于金纳米簇的比率荧光 生物传感器及其制备方法与其在检测曲霉属霉 菌中的应用。 本发明以曲霉属霉菌DNA基因组为 靶标， 通过设计LAMP引物， 在确定引物特异性的 基础上加入FITC@AuNCs进行LAMP反应。 利用BSA 保护的AuNCs作为荧光基团， FITC作为pH的响应 信号， 随着LAMP反应的进行， 大量焦磷酸盐和氢 离子被释放， 导致FITC和AuNCs的比率荧光信号 逐渐下降， 可用于曲霉属霉 菌检测的定量分析。 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图4页 CN 114807418 A 2022.07.29 CN 114807418 A 1.一种基于金纳米簇的比率荧光生物传感器， 其特征在于， 所述比率荧光生物传感器 包括引物探针和FITC@AuNCs， 所述引物探针包括上游外引物、 下游外引物、 上游内引物、 下 游内引物、 上游 环引物和下游 环引物； 所述上游外引物的核苷酸序列如SEQ  ID No.1所示， 所述下游外引物的核苷酸序列如 SEQ ID No.2所示， 所述上游内引物的核苷酸序列如SEQ  ID No.3所示， 所述下游内引物的 核苷酸序列如SEQ  ID No.4所示， 所述上游环引物的核苷酸序列如SEQ  ID No.5所示， 所述 下游环引物的核苷酸序列如SEQ  ID No.6所示。 2.根据权利要求1所述的比率荧光生物传感器， 其特征在于， 所述FITC@AuNCs通过以下 方法制备 得到： 将HAuCl4和BSA溶液混合， 并将反应液pH调节 至碱性， 搅拌反应得到AuNCs； 将所得Au NCs 溶于缓冲液中， 得到AuNCs溶液； 将FITC的醇溶液加入所述AuNCs溶液中， 搅拌得到所述 FITC@AuNCs。 3.一种试剂盒， 其特 征在于， 包括权利要求1 ‑2中任一项所述的比率 荧光生物传感器。 4.如权利要求1 ‑2中任一项所述的比率荧光生物传感器、 权利要求3中所述的试剂 盒在 定量或定性检测霉菌中的应用。 5.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于， 所述霉菌选自曲霉属霉菌、 青霉属霉菌或 镰刀菌属霉菌 。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于， 所述曲霉属霉菌为黑曲霉、 黄曲霉、 集峰曲 霉， 所述青 霉属霉菌为鲜绿青 霉， 所述镰刀菌属为尖孢镰孢。 7.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于， 应用方法包括以下步骤： 将所述引物探针、 所述FITC@AuNCs和曲霉属霉菌的DNA模板混合进行LAMP反应， 待反应结束取LAMP产物， 并检 测所述产物的荧 光强度。 8.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于， LAMP反应还包括isothermal   amplification buffer、 dNTPs、 DNA聚合酶和水。 9.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于， 所述比率荧光生物传感器在检测坚果中曲 霉属霉菌的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特征在于， 检测坚果中曲霉属霉菌的方法包括以下 步骤： S1： 将含曲霉属霉菌的坚果加入灭菌水中振荡， 取振荡后的溶液加入到培养基 中培养， 得到菌丝， 通过菌 丝提取样品基因 组DNA； S2： 将S1所制备的样品基因组DNA与所述引物探针、 FITC@AuNCs溶液进行LAMP反应， 待 反应结束取LAMP产物进行荧 光检测。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807418 A 2一种基于金纳米簇的比率荧光生物传感器及其制备方 法与其 在检测曲霉属霉菌中的应用 技术领域 [0001]本发明涉及食品安全生物技术领域， 尤其涉及一种基于金纳米簇的比率荧光生物 传感器及其制备 方法与其在检测曲霉属霉菌中的应用。 背景技术 [0002]休闲食品是人们间隙、 休憩时所吃的食品， 主要分为谷物类制品、 干果类制品、 糖 食类制品和肉制食品等。 2020年休 闲食品行业总产值达到3万亿元， 预计2025年将超过4万 亿元， 由此可见， 休闲食品行业发展速度迅猛， 发展潜力巨大。 其中坚果炒货行业年产值从 452亿元迅速增长到1214亿元， 年均复合增长率达15.2％， 增速远高于整体休闲食品。 同时， 自2017年以来， 全国各地已陆续查处、 通报198起食品霉菌超标的情况， 坚果炒货类目被通 报霉菌超标的情况占通报总数 的20％， 该问题已逐渐成为行业发展的瓶颈之一。 曲霉属作 为一种常见的腐生菌， 不仅能够产生大量的孢子， 同时还具有不同的生化活性。 因此其分布 广泛， 可以在不同环境和基质上成长， 尤其是在潮湿温暖的环境下 的植物性产品上进行繁 殖并产生霉菌毒素。 然而黄曲霉在腰果、 开心果、 栗子和杏仁等霉变污染中均有报道， 是引 起坚果霉 变的主要污染物。 [0003]目前检测霉菌常用的方法为传统培养法和生化检测技术。 传统培养法即国标法GB   4789.15‑2016 《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》 ， 传统培养 法结果准 确， 但检测周期 较长， 且操作步骤繁琐， 不适合快速、 高效检测的需求。 生化检测技术即通过 霉菌在生长和繁殖 的过程中所产生的代谢产物与特定底物之间的特异性反应来进行种类 和数量的检测。 常用的检测方法有 快速测试片法和ATP生物发光技术检测法， 该类方法虽然 操作简单， 成本低廉， 但检测结果 准确性欠佳。 [0004]分子生物学技术基于核酸及其表达产物的相互关系和相互作用， 为食品霉菌检测 领域提供了新的思路和重要依据。 目前， 基于P CR的检测方法仍是检测食品中霉菌的首选方 法。 基于PCR的检测方法 的有效性取决于其特异性地体外扩增靶标DNA序列， 具有较高的特 异性和灵敏度。 但是， P CR检测无法达到定量， 只能停留在定性的阶段。 同时检测过程中开盖 导致的气溶胶污染会造成检测结果的假阳性。 发明内容 [0005]针对现有技术的不足， 本发明提供了一种基于金纳 米簇的比率荧光生物传感器及 其制备方法与其在检测曲霉属霉菌中的应用。 本发明以曲霉属霉菌基因组为靶标， 通过 DNAMAN软件比对序列， NEB  LAMP PrimerDesignT ool等软件设计LA MP引物， 在确定引物特异 性的基础上加入FITC@AuNCs进行LAMP反应。 利用BSA保护的AuNCs作为荧光基团， FITC作为 pH的响应信号， 随着LAMP反应的进行， 大量焦磷酸盐和氢离子被释放， 导致FITC和AuNCs的 比率荧光信号逐渐下降， 可用于核酸检测的定量分析。 [0006]本发明的目的是通过以下技 术方案实现的：说　明　书 1/8 页 3 CN 114807418 A 3