(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221047425 5.6 (22)申请日 2022.04.29 (71)申请人 上海伯杰医疗科技股份有限公司 地址 201415 上海市奉贤区沪杭公路158 8 号3号楼1302、 1303、 1304、 1305、 1306、 1307、 1309室 (72)发明人 杨运真　朱兆奎　沈林　 (74)专利代理 机构 北京超凡宏宇专利代理事务 所(特殊普通 合伙) 11463 专利代理师 王闯 (51)Int.Cl. C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/70(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 用于基因CDS区域一代测序的嵌套引物对、 测序引物对、 测序试剂、 测序试剂盒及应用 (57)摘要 本发明涉及基因检测技术领域， 尤其是涉及 用于基因CDS区域一代测序的嵌套引物对、 测序 引物对、 测序试剂、 测序试剂盒及应用。 通过设计 开发了一对连接在特异性扩增引物前的通用嵌 套引物， 同时针对该引物设计了一对测序引物。 该引物具备两个功能区域， 通用引物序列区域的 作用在于延长一代测序读取长度， 获取有效的目 的基因CDS序列； 随机碱基序列作为桥梁序列， 其 作用在于区分通用引物序列和特异性扩增的目 的基因序列， 从而能够在扩增产物中快速识别出 目的基因的CDS序列。 最后， 测序引物的作用是作 为一代测序的通用测序引物， 能够降低送测操作 的复杂度。 综上， 本发明不仅能够缩短实验周期， 同时也能降低实验成本 。 权利要求书1页 说明书9页 序列表5页 附图7页 CN 114908151 A 2022.08.16 CN 114908151 A 1.用于基因CDS区域一代测序的嵌套引物对， 其特征在于， 所述嵌套引物对包括正向嵌 套引物和反向嵌套引物， 所述正向嵌套引物的核苷酸序列包括5 ’端至3’端顺序连接的第一 通用序列和随机碱基序列， 所述反向嵌套引物的核苷酸序列包括5 ’端至3’端顺序连接的第 二通用序列和随机碱基序列， 所述第一通用序列和第二通用序列的核苷酸长度为55～ 80bps， 所述随机 碱基序列的长度为5～10bps。 2.根据权利要求1所述的嵌套引物对， 其特征在于， 所述第 一通用序列和第 二通用序列 的核苷酸长度为6 0bps， 所述随机 碱基序列的长度为6bps。 3.根据权利要求2所述的嵌套引物对， 其特征在于， 所述第一通用序列如SEQ  ID No.1 所示， 所述第二 通用序列如SEQ  ID No.2所示。 4.权利要求1～3任一项所述的嵌套引物对在制备基因CD S区域测序 产品中的应用。 5.用于基因CDS区域一代测序的测序引物对， 其特征在于， 所述测序引物对包括长度均 为18～30bps 的正向测序引物和反向测序引物， 所述正向测序引物的核苷酸序列与权利要 求1～3任一项 所述第一通用序列5 ’端的核苷酸片段相同或互补； 所述反向测序引物的核苷 酸序列与权利要求1～3任一项所述第二 通用序列5 ’端的核苷酸片段相同或互补。 6.根据权利要求5所述的测序引物对， 其特征在于， 所述正向测序引物的具体核苷酸序 列如SEQ ID No.3所示； 所述反向测序引物的具体核苷酸序列如SEQ  ID No.4所示。 7.用于基因CDS区域一代测序的通用测序 试剂， 其特征在于， 所述测序 试剂包括权利要 求1～3任一项所述的嵌套引物对和权利要求5或6所述的测序引物对。 8.用于基因CDS区域一代测序的通用测序 试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括权利要 求7所述的通用测序试剂和任选耗材。 9.权利要求7所述的通用测序 试剂或权利要求8所述的通用测序 试剂盒在目的基因CDS 区域测序中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特征在于， 所述目的基因包括流感病毒的HA基因、 NA 基因、 PB1基因、 PB2基因、 NP基因、 MP基因、 PA基因或NS基因。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114908151 A 2用于基因C DS区域一代测序的嵌套引物对、 测序 引物对、 测序 试剂、 测序试剂盒及应用 技术领域 [0001]本发明涉及基因检测技术领域， 尤其是涉及用于基因CDS区域一代测序的嵌套引 物对、 测序引物对、 测序试剂、 测序试剂盒及应用。 背景技术 [0002]一代测序又称为Sanger测序， 其主要特点在于测序读长较长， 一次可以读取 600bps～1000bps的碱基； 至今仍是正确性的金标准， 准确度高达99.999％。 但是， 由于测序 仪器初始时电流电压的不稳定因素， 造成在读取5 ’端下游约50bps的碱基序列时荧光信号 不稳定， 使 得不能获取有效的目的基因CDS区域序列。 为了获取目的基因CDS区域序列， 现在 采取的主要 方法是在5 ’端下游约100b ps的碱基序列处设计一条引物进 行反向测序， 再通过 2条序列的拼接来实现， 此 方法的局限性在于延长 了实验周期， 增 加了实验成本 。 [0003]鉴于此， 特提出本发明。 发明内容 [0004]本发明的目的在于， 提供一种用于基因CDS区域一代测 序的嵌套引物对， 通过所述 嵌套引物对延长一代测序的读取长度， 以获取有效的目的基因完整的CD S序列。 [0005]本发明的第二个目的在于， 提供与上述提供的嵌套引物对特异性结合的测序引物 对， 以及包含上述嵌套引物对和测序引物对的试剂及试剂盒， 期望通过所述测序引物对以 所述嵌套引物对为模板进行扩增， 从而获得的完整 有效的CD S序列。 [0006]为了解决上述 技术问题， 实现上述目的， 本发明提供以下技 术方案： [0007]第一方面， 本发明提供了用于基因CDS区域一代测 序的嵌套引物对， 所述嵌套引物 对包括正向嵌套引物和反向嵌套引物， 所述正向嵌套引物的核苷酸序列包括5 ’端至3’端顺 序连接的第一通用序列和随机碱基序列， 所述反向嵌套引物的核苷 酸序列包括5 ’端至3’端 顺序连接的第二通用序列和随机碱基序列， 所述第一通用序列和 第二通用序列的核苷酸长 度为55～80bps， 所述随机 碱基序列的长度为5～10bps。 [0008]可选实施方式中， 所述第一通用序列和第二通用序列的核苷酸长度为60bps， 所述 随机碱基序列的长度为6bps。 [0009]可选实施方式中， 所述第一通用序列如SEQ  ID No.1所示， 所述第二通用序列如 SEQ ID No.2所示。 [0010]第二方面， 本发明提供了前述任一项实施方式所述的嵌套引物对在制备基因CDS 区域测序 产品中的应用。 [0011]第三方面， 本发明提供了用于基因CDS区域一代测 序的测序引物对， 所述测 序引物 对包括长度均为18～30bps 的正向测序引物和反向测序引物， 所述正向测序引物的核苷酸 序列与前述 实施方式任一项所述第一通用序列5 ’端的核苷 酸片段相同或互补； 所述反向测 序引物的核苷酸序列与前述实施方式任一项所述第二通用序列5 ’端的核苷酸片段相同或说　明　书 1/9 页 3 CN 114908151 A 3