(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210475094.2 (22)申请日 2022.04.29 (71)申请人 温州医科 大学 地址 325000 浙江省温州市瓯海区东方南 路38号温州市国家大 学科技园孵化器 (72)发明人 肖星星　吴四红　林子琴　楼永良　 (74)专利代理 机构 温州名创知识产权代理有限 公司 33258 专利代理师 朱海晓 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/6816(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种基于RAA-CRISPR系统的新型双重致病 性嗜水气单胞菌 检测方法及应用 (57)摘要 本发明涉及一种基于RAA ‑CRISPR系统的新 型致病性嗜水气单胞菌双重检测方法及应用。 本 发明通过对致病性嗜水气单胞菌致病基因 aerA 和hlyA进行研究分析， 首次提出基于RAA ‑CRISPR 系统的新型致病性嗜水气单胞菌双重检测方法， 设计并筛选符合检测要 求的RAA引物组、 crRNA序 列， 既通过双重检测手段降低了漏检几率， 又实 现了对致病性嗜水气单胞菌的简便、 快速、 准确、 灵敏检测。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图5页 CN 114807395 A 2022.07.29 CN 114807395 A 1.一种基于RAA ‑CRISPR系统的新型致病性嗜水气单胞菌双重检测方法， 所述方法为非 疾病诊断目的 的， 其特征在于， 包括以下步骤： （1） 对待测标本进行基因 组提取， 得到待测液； （2） 将Cas12a和crRNA混合物混合孵 育形成的核糖核蛋白体； （3） 在步骤 （2） 得到的核糖核蛋白体中避光加入探针和步骤 （1） 得到的待测液， 进行孵 育以充分切割探针； （4） 用对应于 探针的检测方法进行 结果测定； 其中， 步骤 （2） 中， 所述crRNA混合物包括识别靶标核酸序列 aerA的crRNA和识别靶标核 酸序列hlyA的crRNA。 2.根据权利 要求1所述的基于RAA ‑CRISPR系统的新型致病性嗜水气单胞菌双重检测方 法， 其特征在于： 步骤 （1） 中， 所述待测标本通过NaOH裂解法或试剂盒提取法进行基因组提 取。 3. 根据权利要求1所述的基于RAA ‑CRISPR系 统的新型致病性嗜水气单胞菌双重检测 方法， 其特征在于： 步骤 （2） 中， 所述crRNA混合物包括如SEQ  NO 5所示的ACR1、 如SEQ  NO 6 所示的ACR2、 如SEQ  NO 7所示的HCR1、 如SEQ NO 8所示的H CR2。 4.根据权利 要求1所述的基于RAA ‑CRISPR系统的新型致病性嗜水气单胞菌双重检测方 法， 其特征在于： 步骤 （3） 中， 所述探针为5 ’6‑FAM‑TTATT‑3’BHQ1， 基于该探针， 步骤 （4） 中的 检测方法为UV手电筒或 酶标仪。 5. 根据权利要求1所述的基于RAA ‑CRISPR系 统的新型致病性嗜水气单胞菌双重检测 方法， 其特征在于： 步骤 （2） 中， Cas12a浓度为400 ‑1000 nM， 步骤 （3） 中， 所述探针的浓度为 300‑900 nM， 切割探针的时间为至少20  min。 6. 根据权利要求5所述的基于RAA ‑CRISPR系 统的新型致病性嗜水气单胞菌双重检测 方法， 其特征在于： 步骤 （2） 中， Cas12a浓度为600  nM， 步骤 （3） 中， 所述探针的浓度为500   nM， 切割探针的时间为25  min。 7.如权利 要求1‑6任一项所述的基于RAA ‑CRISPR系统的新型致病性嗜水气单胞菌双重 检测方法用于检测水样或食物样品中的致病性嗜水气单 胞菌的应用。 8. 一种基于RAA ‑CRISPR系统的新型致病性嗜水气单胞菌双重检测试剂盒， 其特征在 于： 包括细胞裂解体系、 Cas12a、 crRNA混合物、 探针， 所述crRNA混合物包括如SEQ  NO 5所示 的ACR1、 如SEQ NO 6所示的ACR2、 如SEQ  NO 7所示的HCR1、 如SEQ NO 8所示的H CR2。 9.根据权利 要求8所述的基于RAA ‑CRISPR系统的新型致病性嗜水气单胞菌双重检测试 剂盒， 其特征在于： 所述细胞裂解体系包括氢氧化钠溶液， 所述探针5 ’6‑FAM‑TTATT‑3’ BHQ1， 所述试剂盒中还 包括UV手电筒。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807395 A 2一种基于RA A‑CRISPR系统的新型双重致病性嗜水气单胞菌检 测方法及应用 技术领域 [0001]本发明涉及一种基于RAA ‑CRISPR系统的新型致病性嗜水气单胞菌双重检测方法 及应用。 背景技术 [0002]嗜水气单胞菌是一种具有广泛致病性的人畜共患病原体， 在自然界中广泛分布。 对人而言， 嗜水气单胞菌是一种新兴的肠道、 水源性、 食源性致病菌， 严重危及人体健康乃 至生命； 对水生动物而言， 它是引起鱼类运动性气单胞菌败血症的主要病原体， 感染后死亡 率高， 对水产养殖业造成沉重经济损失。 嗜水气单胞菌的致病性与毒力因子密切相关。 据报 道， 致病性嗜水气单胞菌， 如aerA+hlyA‑、 aerA‑hlyA+和aerA+hlyA+亚型， 能在水、 土壤和食物 （包括牛奶、 鱼、 猪肉等） 中生长繁殖， 并且在冷藏过程中仍会产生主要毒力因子气溶素 （aerA） 和/或溶血素 （hlyA） 。 人主要通过暴露的伤口和摄入了受污染的水和食物而感染嗜 水气单胞菌， 引起的菌血症、 坏死性筋膜炎发病急、 进展迅速， 2 4小时内达到全身毒性状态， 危及生命。 早期 检测和及时用药可大大缩短治疗周期、 降低死亡率， 以及降低水产养殖业的 经济损失。 因此， 开 发一种简 便、 快速、 特异、 灵敏的致病性嗜水气单胞菌检测方法具有极其 重要的应用价 值。 [0003]嗜水气单胞菌的传统检测方法有培养法、 生化试验、 酶联免疫吸附试验、 斑点杂交 法、 血清学分型等。 传统培养法鉴定结果准确， 但是耗时长， 不仅延误治疗时机， 而且加大了 传播疾病的可能； 生化试验操作复杂且生化特征有限， 仅能检测典型菌株， 容易漏检； 酶联 免疫吸附试验、 斑点杂交法、 血清学分型等方法检测灵敏度低。 这些方法存在耗时长、 操作 复杂、 灵敏度低等问题， 逐渐 被新兴技 术取代。 [0004]随着分子生物学的迅猛发展， 基于聚合酶链式反应 （PCR） 技术开发了多种检测方 法， 可通过对毒力基因扩增来检测嗜水气单胞菌； 然而， 这些方法需要专门的人员和专用设 备， 无法实现在非 实验场所的检测， 限制了其在户外和资源匮乏地区的应用。 [0005]等温核酸扩增技术 RAA （recombinase ‑aid amplificat ion） 具有 无需热循环仪、 反 应条件要求低甚至体热10  min即可完成等优点， 大大推动了核酸检测技术的发展， 已用于 包括创伤弧菌和沙门氏菌在内的多种病原的检测， 但是这种技术也存在一定局限性， 扩增 产物常需纯化、 电泳分析以判定检测结果， 加重了气溶胶污染问题， 提高了假阳性风险。 此 外， 当前常见的检测方法由于仅扩增单一基因， 导致漏检 （靶向单一毒力基因） 甚至错检 （靶 向16S rRNA） 。 [0006]综上所述， 需要一种简便、 快速、 准确、 灵敏的致病性嗜水气单 胞菌的检测方法。 发明内容 [0007]本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足， 而提供一种基于RAA ‑ CRISPR系统的新型致病性嗜水气单 胞菌双重检测方法及应用。说　明　书 1/6 页 3 CN 114807395 A 3