(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221047479 2.0 (22)申请日 2022.04.29 (71)申请人 北京市农林科 学院 地址 100097 北京市海淀区曙光 花园中路9 号 (72)发明人 张建　温常龙　杨静静　张晓飞　 夏昌选　赵泓　毛爱军　 (74)专利代理 机构 北京五洲洋和知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11387 专利代理师 荣红颖　刘春成 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种鉴定欧洲水果型黄瓜的方法及其专用 SNP引物组和应用 (57)摘要 本发明属于生物 技术领域， 提供一种鉴定欧 洲水果型黄瓜的方法及其专用SNP引物组和应 用。 所述SNP位点为如下第二SNP位点和/或第三 SNP位点： 第二SNP位点SNP02位于2号染色体的 3924266处， 该位点的核苷酸碱基为T或C； 第三 SNP位点SNP03位于3号染色体的1870398处， 该位 点的核苷酸碱基为C或A； 第二SNP位点： T:T纯合 型为非欧洲水果型黄瓜的基因型， C:C纯合型为 欧洲水果型黄瓜的基因型； 第三SNP位点： C:C纯 合型为非欧洲水果型黄瓜的基因型， A:A纯合型 为欧洲水果型黄瓜的基因型。 利用本发明的SNP 位点及其专用引物组， 可 以高效、 准确地鉴定出 欧洲水果型黄瓜， 可显著提高品种黄瓜品种选育 和种群鉴定效率。 权利要求书2页 说明书13页 序列表5页 附图3页 CN 114836563 A 2022.08.02 CN 114836563 A 1.一种用于鉴定欧洲水果型黄瓜的SNP位点， 其特征在于， 所述SNP位点为如 下第二SNP 位点和/或第三SNP位点： 第二SNP位点SNP02， 所述第二SNP位点位于2号染色体的3924266 处， 该位点的核苷酸碱基为T或C； 第三SNP位点SNP03， 所述第三SNP位点位于3号染色体的1870398处， 该位点的核苷酸碱 基为C或A； 第二SNP位点对应的基因型： T:T纯合型为非欧洲水果型黄瓜的基因型， C:C纯合 型为欧洲水果型黄瓜的基因型； 第三SNP位点对应的基因型： C:C纯合型为非欧洲水果型黄瓜的基因型， A:A纯合型为欧 洲水果型黄瓜的基因型。 2.一种用于鉴定欧洲水果型黄瓜的SNP引物 组， 其特征在于， 所述引物 组选自第二KASP 引物对和/或第三KASP引物对， 所述第二KASP引物对用于扩增用于鉴定欧洲水果型黄瓜的 第二SNP位点， 或确定第二SNP位点对应的基因型； 所述第三KASP引物对用于扩增用于鉴定 欧洲水果型黄瓜的第三SNP位点， 或确定第三SNP位点对应的基因型； 每个KASP引物对均包 括： 第一正向引物、 第二 正向引物和通用反向引物。 3.如权利 要求2所述的SNP引物组， 其特征在于， 所述第二KASP引物对中： 第一正向引物 的碱基序列如序列表SEQ  ID NO.1所示， 具体为： 5 ’ ‑GTATGGATATGTGAAGGATATGGTGT ‑3’； 第 二 正 向 引 物 的 碱 基 序 列 如 序 列 表 S E Q  I D N O .2 所 示 ，具 体 为 ：5 ’‑ TATGGATATGTGAAGGATATGGTGC ‑3’； 通用反向引物的碱基序列如序列表SEQ  ID NO.3所示， 具 体为： 5’ ‑GAATAATTATATCACGGTGAATGTAGAAGTTTG ‑3’； 所述第三KASP引物对中： 第一正向引 物的碱基序列如序列表SEQ  ID NO.4所示， 具体为： 5 ’ ‑TCTTTCAATCAAATCCATTTCCTATGATC ‑ 3’； 第二正向 引物的 碱基 序列如序列表SEQ  I D NO .5所示 ， 具体为 ： 5 ’‑ CTCTTTCAATCAAATCCATTTCCTATGATA ‑3’； 通用反向引物的碱基序列如序列表SEQ  ID NO.6所 示， 具体为： 5 ’ ‑GCAACGGTTTAGGTCAAGAAGATCAAG‑3’。 4.如权利要求2所述的SNP引物组， 其特征在于， 每个KASP引物对中的所述第一正向引 物和第二 正向引物的5 ’端分别连有不同的荧 光接头序列。 5.如权利要求4所述的SNP引物组， 其特征在于， 所述荧光接头序列选择FAM、 HEX、 FITC、 RED、 TET、 JOE、 R 110中的一种。 6.一种试剂盒， 包括上述引物组和PCR反应试剂。 7.如权利要求7所述的试剂盒， 其特征在于， 所述PCR反应试剂为具有竞争性等位基因 特异性PCR检测能力的试剂； 优选地， 所述PCR反应试剂为Master  mix。 8.如权利 要求1所述的SNP位点、 或者权利 要求2‑5所述的SNP引物组、 或者权利 要求6或 7所述的试剂盒在以下任一方面的应用： (a)辅助选育欧洲水果型黄瓜的品种； (b)鉴定黄瓜 品种是否为欧洲水果型黄瓜。 9.一种鉴定欧洲水果型黄瓜的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： (1)待测黄瓜样品基因组DNA的提取； (2)以待测黄瓜样品基因组DNA为模板， 分别利用 上述引物组中的各引物对进行PCR扩增； (3)对扩增产物进行荧光检测和分析， 获得待测 黄 瓜样品对应SNP位点的基因型， 由此确定待测黄瓜品种是否为欧洲水果型黄瓜； 其中确定待 测黄瓜样品是否为欧洲水果型黄瓜的条件选自如下中的一种或多种： 当基于第二SNP位点SNP02的基因型为T:T纯合型时， 待测黄瓜样品为非欧洲水果型黄 瓜； 基于第二SNP位 点SNP02的基因型为C:C纯合型时， 待测黄瓜样品为欧洲水果型黄瓜；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114836563 A 2或者/和， 当基于第三SNP位点SNP03 的基因型为C:C纯合时， 待测黄瓜样品为非欧洲水 果型黄瓜； 基于第三SNP位点SNP03的基因型为A:A纯合型时， 待测黄瓜样品为欧洲水果型黄 瓜。 10.如权利要求9所述的方法， 其特征在于， 所述PCR扩增的条件依次为： 94℃预变性15 分钟； 在94℃下变性20s， 61℃ ‑55℃下退火1min， 共10个循环， 61℃为第一个循环的退火温 度， 之后每个循环退火温度降低0.6℃； 94℃变性20s， 55℃复性/延伸1min， 共26个循环； 优 选地， 所述引物组中， 各引物对的第一正向引物、 第二正向引物和通用反向引物在PCR体系 中的浓度比为2:2:5； 优选地， 所述待测黄瓜样品基因 组DNA的浓度为10 ‑30ng/ μL。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114836563 A 3