(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210470631.4 (22)申请日 2022.04.28 (71)申请人 南京法迈特 科技发展 有限公司 地址 210000 江苏省南京市高淳区经济开 发区汶溪路128号3 栋2层 (72)发明人 盛健　王昊炜　徐奚如　 (74)专利代理 机构 北京商专永信知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11400 专利代理师 周军 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种鉴定人肠道脆弱拟杆菌的引物对及其 应用 (57)摘要 本发明公开了一种鉴定人肠道脆弱拟杆菌 的引物对， 包括正向引物和反向引物， 采用所述 引物对能够特异性地扩增人肠道中的脆弱拟杆 菌。 本发明公开了基于PCR技术的人肠道脆弱拟 杆菌鉴定的方法， 可直接以人类粪便为模板， 检 测其是否含有脆弱拟杆菌以及含有脆弱拟杆菌 的相对丰度。 本发明通过降低PCR缓冲液中MgCl2 浓度， 与配对脆弱拟杆菌16S  rRNA的多对PCR引 物组合试验， 在调整PCR反应步骤的基础上， 以获 得最佳的实时定量PCR效果， 并实现了对粪便稀 释物的直接PCR鉴定。 运用本发明的技术方案， 可 一次性、 快速鉴定人类肠道中是否含有脆弱拟杆 菌， 无需对受试人粪便中肠道菌群的分离后再行 鉴定。 减少了试验步骤， 节约检测时间。 权利要求书1页 说明书8页 序列表5页 附图2页 CN 114959078 A 2022.08.30 CN 114959078 A 1.一种鉴定人肠道脆弱拟杆菌的引物对， 包括正向引物和反 向引物， 其特征在于， 所述 正向引物和反向引物的序列分别如SEQ  ID NO:1和2所示。 2.一种荧光定量PCR反应体系， 其特征在于， 包括： 10 ×PCR buffer、 SYBR  Green I、 dNTP、 模板、 正向引物和反向引物， 所述正向引物和反向引物的序列分别如SEQ  ID NO:1和2 所示。 3.根据权利要求2所述的反应体系， 其特征在于， 所述10 ×PCR buffer的配方为： 500mmol/L KCl， 100mmol/L pH 8.3Tris‑HCl， 5‑50mmol/L MgCl2； 优选的， 所述MgCl2浓度为5m mol/L。 4.一种鉴定人肠道脆弱拟杆菌的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包括权利要求1所述 的引物对和/或权利要求2 ‑3任一权利要求所述的反应 体系。 5.根据权利要求4所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒还包括脆弱拟杆菌标准品溶 液。 6.一种鉴定人肠道脆弱拟杆菌的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： 1)将受试者粪便样本稀释制备成粪便稀释物； 2)将步骤(1)中的粪便稀释物作为模板建立PCR反应体系， 所述反应体系包括： 10 ×PCR  buffer、 SYBR  Green I、 dNTP、 模板、 正向引物和反向引物， 所述正向引物和反向引物的序列 分别如SEQ  ID NO:1和2所示； 3)PCR扩增； 4)根据扩增结果判断样本中的脆弱拟杆菌是否存在， 所述方法为非疾病诊断目的。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述10 ×PCR buffer的配方为： 500mmol/L   KCl， 100mmol/L pH 8.3Tris‑HCl， 5‑50mmol/L MgCl2； 优选的， 所述MgCl2浓度为5m mol/L。 8.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述步骤1)中的粪便样本稀释步骤为： 取 受试者粪便0.5g置于灭菌的1.5mL离心管， 4℃存放， 将所取样品溶于50mL生理盐水， 从中吸 取1mL悬浮液， 用生理盐水稀释10 0倍， 备用。 9.根据权利要求6 ‑8任一权利要求所述的方法， 其特征在于， 所述步骤3)中的PCR扩增 条件为： (1)预变性， 98℃， 10min； (2)变性， 96℃， 30s； (3)退火， 60℃， 30s； (4)延伸， 72℃， 40s； (5)重复步骤(2)～(4)1次； (6)变性， 96℃， 30s； (7)退火， 58℃， 30s； (8)延伸， 72℃， 40s； (9)重复步骤(6)～(8)1次； (10)变性， 9 6℃， 30s； (11)退火， 56℃， 30s； (12)延伸， 72℃， 40s； (13)重复步骤(10)～(12)3 5次； (14)继续延伸， 72℃， 7mi n。 10.权利要求1所述的引物对和/或权利要求2 ‑3任一项所述的反应体系在制备检测人 肠道脆弱拟杆菌试剂盒中的用途。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114959078 A 2一种鉴定人肠道 脆弱拟杆菌的引物对及其应用 技术领域 [0001]本发明属于荧光定量PCR检测领域， 具体涉及一种鉴定人肠道脆弱拟杆菌 的引物 对， 用于鉴定人肠道脆弱拟杆菌的荧 光定量PCR反应 体系及其应用。 背景技术 [0002]脆弱拟杆菌(Bacteroides  fragilis)是临床上最常见的一种厌氧菌。 能分解糖， 对胆汁耐受， 为类杆菌属的代表株。 革兰氏阴性杆菌， 两端钝圆而浓染， 中间有不着色部份。 在正常情况下， 它能维持人体消化系统平衡和机体抵抗力， 是免疫系统的驱动力， 已被应用 于健康领域。 [0003]脆弱拟杆菌对人体既有利， 又有害， 具有双重作用。 它可以释放消炎物质， 帮助免 疫系统保持平衡。 很多时候， 它对我们的免疫系统发号施令， 进行操纵。 这种操纵并不会抑 制或减弱我们免疫系统的性能， 相反， 还有助于免疫系统发挥功能。 另一方面， 脆弱拟杆菌 常寄生于人的口腔、 肠道和女性生殖道， 是一种条件致病菌， 主要为内源性感染， 可引起女 性生殖系统、 胸腔和颅内感染。 [0004]现有鉴定脆弱拟杆菌的方法有基于形态学观察、 生化试验、 分子生物学实验等。 脆 弱拟杆菌的触酶试验阳性， 发酵葡萄糖、 麦芽糖和蔗糖， 不 发酵阿拉伯糖、 鼠李糖、 山梨 醇和 海藻糖， 胆汁七叶苷试验 阳性， 吲哚试验 阴性， 耐20％胆盐。 脆弱拟杆菌是革兰阴性杆菌， 大 小为(0.8～1.3)μm ×(1.6～8)μm， 染色不均， 两端圆而深染， 中间不着色或染色较浅， 似为 空泡。 培养物呈明显的多形性， 在液体培养基尤其在含糖的培养基中， 为长丝状或其他形 状。 [0005]目前， 已经公开报道基于分子生物学实验鉴定脆弱拟杆菌的方法有2个。 谢湘峰等 (巢式PCR结合微孔板杂交技术鉴定脆弱拟杆菌.中国实验诊断学,2002,(02):75)报道的方 法， 技术相对繁琐， 涉及实验仪器和设备较多。 张煜坤等(选择性培养基结合特异引物法分 离鉴定家兔肠道 脆弱拟杆菌.家畜生态学报,2015,36(03):58)报道的方法仅限于家兔肠道 脆弱拟杆菌的鉴定 。 [0006]人类粪便 的主要成分包括水和固体成分， 其中水约占总质量的四分之三， 其余四 分之一是固体。 固体物质大多 是蛋白质、 无机物、 脂肪、 未消化的食物纤维、 从肠道脱落的细 胞和死掉的细菌、 以及大量金属离子等。 由于粪便成分的复杂性， 且各组分含量不恒定， 对 于肠道特定 菌种的生 化或分子生物学鉴定带来了极大难度和不确定性。 [0007]目前， 已有的检测脆弱拟 杆菌的方法已经不能进一步满足对于人肠道中脆弱拟 杆 菌的直接检测 和定量分析的要求。 发明内容 [0008]本发明公开了一种基于PCR技术的人肠道脆弱拟杆菌鉴定的方法， 本发明可直接 以人类粪便为模板， 直接检测其是否含有脆弱拟杆菌以及含有脆弱拟杆菌的相对丰度。 [0009]本发明公开了一种鉴定人肠道脆弱拟杆菌 的引物对， 包括正向引 物和反向引物，说　明　书 1/8 页 3 CN 114959078 A 3