(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210455413.3 (22)申请日 2022.04.28 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114561473 A (43)申请公布日 2022.05.31 (73)专利权人 南京世和基因生物技 术股份有限 公司 地址 210032 江苏省南京市高新 开发区华 康路128号 专利权人 南京世和医疗器 械有限公司 (72)发明人 邵阳　朱柳青　那成龙　陈晨　 汪笑男　吴雪　常志力　孟齐　 (74)专利代理 机构 南京新慧恒 诚知识产权代理 有限公司 32424 专利代理师 邓唯(51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) 审查员 季璇馨 (54)发明名称 PML-RARA融合基因突变的检测方法 (57)摘要 本发明提供一种PML ‑RARA融合基因突变的 检测方法， 本发明中通过下一代测序技术 （NGS） 方法能够准确地检测出PML和RARA的融合基因发 生的变化情况， 本发明的方法能够同步检测基因 突变、 缺失、 增加、 和颠换等多种基因变异类型， 全面指导临床急性早幼粒细胞白血病 （acute   promyelocytic  leukemia,APL） 的诊断， 指导后 续砷剂或全反式维甲酸 （ATRA） 治 疗和耐药选择。 权利要求书1页 说明书6页 序列表30页 附图4页 CN 114561473 B 2022.08.12 CN 114561473 B 1.一种试剂盒， 包括探针， 其特征在于， 所述的探针 的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1‑160 所示； 所述的试剂盒用于对PML ‑RARA融合基因突变进行检测。 2.权利要求1所述的试剂盒在用于制备急性 早幼粒细胞白血病诊断试剂中的应用。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特 征在于， 所述的应用中还 包括如下步骤： 步骤1， 获得DNA样本； 步骤2， 对DNA样本依次进行末端修饰、 加接 头、 与探针杂交后， 进行富 集； 步骤3， 对富 集产物进行PCR扩增后， 进行NGS测序。 4.根据权利 要求3所述的应用， 其特征在于， 所述的步骤1中， DNA样本是由组织样本、 血 浆样本、 腹水样本或者胸水样本进行提取 得到。 5.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述的PML ‑RARA融合基因至少包含了PML 基因的外显子区域、 内含子6区域、 内含子3区域， 以及RARA基因的外显子区域、 内含子2区 域。 6.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述的步骤2中， 所述的与探针杂交是指通 过5'端带有生物素的探针与DNA样 本进行结合； 所述的富集是通过DNA样 本与带有链霉亲和 素的磁珠进行 结合而得到 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114561473 B 2PML‑RARA融合基因 突变的检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于基因检测技术领域， 具体涉及一种PML ‑RARA融合基因突变的检测方 法。 背景技术 [0002]急性早幼粒细胞白血病 （acute  promyeloc ytic leukemia,  APL） 是急性髓细胞白 血病 （AML） 的一种特殊亚型， 发病率占急性白血病的6～9%。 据统计， 国内APL发病率高于西 方国家10%左右， 占AML的18.7%， 部分地区比如东北油田的发病率则高达20% 〜30%。 约98%的 APL伴有经典的t(15;17)(q22;q21)染色体易位， 易位使15q22上的PML基因与17q21上的维 甲酸受体α 基因发生交互性重排， 产生PML/RARA融合基因， 其蛋白产 物导致细胞分化阻滞和 凋亡不足， 是APL发生的主要分子机制。 PML ‑RARA融合基因依据PML断裂位置不同， 有三种亚 型， 分别为Bcr1、 Bcr2和Bcr3， 分别称为长型(L型)、 变异型(V型)和短型(S型)， 发生的概率 则依次为55%、 5%和40%。 另有低于2%的APL  患者表现为其他非经典PML ‑RARA融合。 APL临床 发病急， 起病及诱导治疗过程中容易 发生出血和栓塞， 曾是最凶险的急性白血病， 然而近年 来全反式维甲酸 （ATRA） 及三氧化二砷的规范化临床应用， 能靶向降解PML/RARA融合蛋白， 恢复野生型PML和RARA 基因功能， 可使APL的完全缓解率达90% ‑95%， 并可使APL患者的5年无 病生存率达到90%以上。 同期研究表明部分复发性或顽固性APL患者， 再用砷剂治疗效果较 差。 这部分人群原发性耐药的主要原因是可能存在特殊变异型APL， 即RARA基因与除PML基 因以外的其他伙伴基因发生的易位， 或者RARB、 RARG的罕见融合类型。 而部分复发难治的 APL患者主要的耐药机制是PML ‑RARA融合基因出现获得性的突变。 有研究发现30%～40% 复 发患者PML ‑RARA融合基因RARA部分配体结构域 （LBD） 存在突变， 由于基因突变的LBD构象发 生改变， ATRA对其结合力降低， 且释放核受体共抑制复合物与招募激活复合物异常， 导致对 ATRA耐药。 而PML ‑RARA融合基因的PML部分B ‑box锌指结构域B2区基因突变， 能够减弱砷剂 对PML‑RARA的负调控， 导致癌蛋白保留， 已被证实的耐药位点有A216V、 S214L、 L218P、 A216T 等。 因此临床准确的检测PML ‑RARA融合极其相关耐药突变是鉴别APL、 指导后续用药、 以及 后续微小残留灶 （MRD） 监测的基础。 [0003]现有的主流PML ‑RARA融合 突变检测方法主 要集中于以下3个技 术： [0004]1.PCR法： PCR检测灵敏度高， 但只能用于已知转录本的检测， 比如PML/RARA融合基 因会出现一些不常见的融合形式。 同时P CR方法只能检测很小 范围内的基因序列， 耐药位点 检测不全面。 而当基因序列发生变异时， 易出现假阴性结果。 [0005]2.核型分析： 常规核型分析的灵敏度低， 有典型的染色体易位可以检测出来， 需要 对样本进行细胞培养， 受制于中期染色体质量； 对于不 典型易位或隐匿型易位较难检测； 无 法进行耐药位 点检测。 [0006]3.荧光原位杂交 （FISH） ： 采用双色探针直接靶定断裂点两端检测PML/RARA融合基 因， 具有敏感， 特异， 高效的特点， 是临床常用检测 手段。 但是对于样本要求较高， 无法进行 血液等液体样本检测。 对于不 典型易位或隐匿型易位， 也可能造成漏检。 无法进 行耐药位点说　明　书 1/6 页 3 CN 114561473 B 3