(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221045415 5.7 (22)申请日 2022.04.27 (71)申请人 江西烈冰生物科技有限公司 地址 334000 江西省上饶市信州区上饶大 道18号6幢1-1,1-2 (72)发明人 陈岱　 (51)Int.Cl. C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种偶联随机长片段核酸序列的磁珠制备 工艺 (57)摘要 本发明提供了一种偶联随机长片段核酸序 列的磁珠制备工艺， 具体包 括： 通过Oligo溶解的 P1、 P2和P3对应的试剂； 将P1、 P2和P3与其互补的 序列R1、 R2和R3通过再经过进行退火互补成双 链， 通过第一步连接反应将P1+R1双链结构连接 磁珠、 然后通过将磁珠混合拆分进行第二步连接 反应、 第三步连接反应， 从而连接P2+R2双 链结构 和P3+R3双链结构， 最终通过解链获得具有分子 随机长片段核酸序列的磁珠。 本发明操作简单， 生成成本低， 制备成功率高且有很好的单细胞测 序结果的稳定性和精确性。 权利要求书2页 说明书4页 附图1页 CN 114836519 A 2022.08.02 CN 114836519 A 1.一种偶联随机 长片段核酸序列的磁珠制备工艺， 其特 征在于， 具体包括以下步骤： (1)Oligo溶解： 取oligo置于离心机中， 12000rpm离心2min使oligo沉降到底部， 加入适 量的纯水溶解至终浓度为50 μM； 室温静置10min， 将上述溶解的oligo漩涡震荡20s， 掌上离 心机顺时针离心使oligo沉降在底部， 形成第一段oligo(P1)、 第二段oligo(P2)和第三段 oligo(P3)对应的试剂， 置 于4℃保存备用， 如使用频率 不高， 可置 于‑20℃保存备用； (2)将第一段oligo(P1)、 第二段oligo(P2)和第三段oligo(P3)与其互补的序列第一段 辅助序列(R1)、 第二段辅助序列(R2)和第三段辅助序列(R3)分别进行退火互补成双链， 形 成第一段双链oligo(P1+R1)、 第二段双链oligo(P2+R2)和第 三段双链oligo(P3+R3)放4度 或‑20度保存待用； (3)第一步连接反应： 将多条第一段双链oli go(P1+R1)分装在分装在的孔板上， 每种加 入5μL， 每孔对应一种P1+R1双链结构； 取1ml羧基磁珠于5ml离心管中， 用pH  5.0的100mM   MES缓冲液清洗3遍后加入100mM的MES 缓冲液至终体积为1.25ml， 加入1.25ml  100mg/mL的 EDC， 混匀， 用8道移液器将其分装在上述装有P1+R1双链结构的孔板中； 贴上封口膜密封， 离 心机中顺时针离心10s， 将孔板固定在25℃垂直悬摇2h； 结束后， 将孔板中磁珠于收集于离 心管中； 加入 纯水轻柔吹吸混匀磁珠， 将 磁珠置于磁力架上， 静置20 s， 弃上清， 重复两次； 加 入0.9ml的纯 水， 得到第二 步连接反应使用磁珠混合物； (4)第二步连接反应： 将多条第二段双链oligo(P2+R2)分装在的孔板， 每种加入3 μL， 每 孔对应一种P2+R2双链结构； 向步骤(3)中得到的磁珠混合物中加入5 ×T4 DNA Ligase  Buffer 400 μL和T 4 DNA Ligase 100 μL， 终体积为1.4mL的混合体系； 用8道移液器将其分装 在上述盛有P2+R2双链结构的孔板中， 每个孔中加入14 μL， 混匀， 在25℃垂直悬摇1h； 反应结 束后置于PCR仪上65℃处理10 min使酶变性失活， 收集全体磁珠于离心管中加入 纯水轻柔吹 吸混匀磁珠， 将 磁珠置于磁力架上， 静置20 s， 弃上清， 重复两次； 加入适量的纯水， 得到第三 步连接反应使用的磁珠混合物； (5)第三步连接反应： 将多条第三段双链oligo(P3+R3)分装在的孔板中， 每种加入3 μL， 每孔对应一种P3+R3双链结构； 向步骤(4)中得到的磁珠混合物中加入5 ×T4 DNA Ligase  Buffer 400 μL和T4  DNALigase  100 μL， 终体积为1.4mL的混合体系； 用8道移液器将其分装 在上述盛P3+R3双链结构的孔板中， 每个孔中加入14 μL， 混匀， 在25℃ 垂直悬摇1h； 反应结束 后置于PCR仪上6 5℃处理10min使酶变性失活， 收集全体 磁珠于离心管中； (6)解链： 向步骤(5)中收集的磁珠加入2ml  150mM NaOH+0.5％Brij  35P轻柔吹吸混匀 磁珠， 将磁珠置于磁力架上， 静置20s， 弃上清； 将磁珠从磁力架上取下后加入2ml  100mM  NaOH+0.5％Brij  35P轻柔吹吸混匀磁珠， 将磁珠置于磁力架上， 静置20s， 弃上清， 重复一 次； 将磁珠从磁力架上取下， 加入2mL的纯水， 轻柔吹吸混匀 磁珠， 将磁珠置于磁力架上， 静 置20s， 弃 上清， 重复两次加入1mL的0.1 ×TE， 获得具有分子随机 长片段核酸序列的磁珠。 2.根据权利要求1所述的一种偶联随机长片段核酸序列的磁珠制备工艺， 其特征在于： 所述第一段oligo(P1)、 第二段oligo(P2)和第三段oligo(P3)对应的序列分别为： 第一段 oligo(P1)： CTACACGACGCTCTTCCGAT  CTB1～B1L1～L1， 其中B1， L1为A、 T、 C、 G任 一碱基，“～” 为4‑16个任意序列； 第二段oligo(P2)： B 2～B2L2～L2， 其中B2， L2为A、 T、 C、 G任一碱基， “～” 为4‑16个任意序列； 第三段oligo(P3)： B3～B3N～N 【TTT】 ， 其中B3， N均为A、 T、 C、 G任一碱基， 且“～”为4‑16个任意序列， 【TTT】 为10 ‑30个T； 第一段辅助序列(R1)、 第二段辅助序列(R2)权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114836519 A 2和第三段辅助序列(R3)分别为： 第一段辅助序列(R1)： 部分前段序列和B1～B1的互补序列； 第二段辅助序列(R2)： L1～L1B2～B2的互补序列； 第三段辅助序列(R3)： L2～L2B3～B3的互 补序列； 且上述序列中P1、 P2、 P3三段中的B1～B1、 B2 ～B2、 B3～B3为 不同序列。 3.根据权利要求1所述的一种偶联随机长片段核酸序列的磁珠制备工艺， 其特征在于： 所述步骤(2)中退火互补成双链的方法为在PCR仪中进行反应， 反应程序为95℃5min， 0.05 ℃/s降至20℃， 20℃1mi n； 或Shaker:95℃5mi n， 55℃2h进行 连接。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114836519 A 3