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(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221045415 5.7 (22)申请日 2022.04.27 (71)申请人 江西烈冰生物科技有限公司 地址 334000 江西省上饶市信州区上饶大 道18号6幢1-1,1-2 (72)发明人 陈岱  (51)Int.Cl. C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种偶联随机长片段核酸序列的磁珠制备 工艺 (57)摘要 本发明提供了一种偶联随机长片段核酸序 列的磁珠制备工艺, 具体包 括: 通过Oligo溶解的 P1、 P2和P3对应的试剂; 将P1、 P2和P3与其互补的 序列R1、 R2和R3通过再经过进行退火互补成双 链, 通过第一步连接反应将P1+R1双链结构连接 磁珠、 然后通过将磁珠混合拆分进行第二步连接 反应、 第三步连接反应, 从而连接P2+R2双 链结构 和P3+R3双链结构, 最终通过解链获得具有分子 随机长片段核酸序列的磁珠。 本发明操作简单, 生成成本低, 制备成功率高且有很好的单细胞测 序结果的稳定性和精确性。 权利要求书2页 说明书4页 附图1页 CN 114836519 A 2022.08.02 CN 114836519 A 1.一种偶联随机 长片段核酸序列的磁珠制备工艺, 其特 征在于, 具体包括以下步骤: (1)Oligo溶解: 取oligo置于离心机中, 12000rpm离心2min使oligo沉降到底部, 加入适 量的纯水溶解至终浓度为50 μM; 室温静置10min, 将上述溶解的oligo漩涡震荡20s, 掌上离 心机顺时针离心使oligo沉降在底部, 形成第一段oligo(P1)、 第二段oligo(P2)和第三段 oligo(P3)对应的试剂, 置 于4℃保存备用, 如使用频率 不高, 可置 于‑20℃保存备用; (2)将第一段oligo(P1)、 第二段oligo(P2)和第三段oligo(P3)与其互补的序列第一段 辅助序列(R1)、 第二段辅助序列(R2)和第三段辅助序列(R3)分别进行退火互补成双链, 形 成第一段双链oligo(P1+R1)、 第二段双链oligo(P2+R2)和第 三段双链oligo(P3+R3)放4度 或‑20度保存待用; (3)第一步连接反应: 将多条第一段双链oli go(P1+R1)分装在分装在的孔板上, 每种加 入5μL, 每孔对应一种P1+R1双链结构; 取1ml羧基磁珠于5ml离心管中, 用pH  5.0的100mM   MES缓冲液清洗3遍后加入100mM的MES 缓冲液至终体积为1.25ml, 加入1.25ml  100mg/mL的 EDC, 混匀, 用8道移液器将其分装在上述装有P1+R1双链结构的孔板中; 贴上封口膜密封, 离 心机中顺时针离心10s, 将孔板固定在25℃垂直悬摇2h; 结束后, 将孔板中磁珠于收集于离 心管中; 加入 纯水轻柔吹吸混匀磁珠, 将 磁珠置于磁力架上, 静置20 s, 弃上清, 重复两次; 加 入0.9ml的纯 水, 得到第二 步连接反应使用磁珠混合物; (4)第二步连接反应: 将多条第二段双链oligo(P2+R2)分装在的孔板, 每种加入3 μL, 每 孔对应一种P2+R2双链结构; 向步骤(3)中得到的磁珠混合物中加入5 ×T4 DNA Ligase  Buffer 400 μL和T 4 DNA Ligase 100 μL, 终体积为1.4mL的混合体系; 用8道移液器将其分装 在上述盛有P2+R2双链结构的孔板中, 每个孔中加入14 μL, 混匀, 在25℃垂直悬摇1h; 反应结 束后置于PCR仪上65℃处理10 min使酶变性失活, 收集全体磁珠于离心管中加入 纯水轻柔吹 吸混匀磁珠, 将 磁珠置于磁力架上, 静置20 s, 弃上清, 重复两次; 加入适量的纯水, 得到第三 步连接反应使用的磁珠混合物; (5)第三步连接反应: 将多条第三段双链oligo(P3+R3)分装在的孔板中, 每种加入3 μL, 每孔对应一种P3+R3双链结构; 向步骤(4)中得到的磁珠混合物中加入5 ×T4 DNA Ligase  Buffer 400 μL和T4  DNALigase  100 μL, 终体积为1.4mL的混合体系; 用8道移液器将其分装 在上述盛P3+R3双链结构的孔板中, 每个孔中加入14 μL, 混匀, 在25℃ 垂直悬摇1h; 反应结束 后置于PCR仪上6 5℃处理10min使酶变性失活, 收集全体 磁珠于离心管中; (6)解链: 向步骤(5)中收集的磁珠加入2ml  150mM NaOH+0.5%Brij  35P轻柔吹吸混匀 磁珠, 将磁珠置于磁力架上, 静置20s, 弃上清; 将磁珠从磁力架上取下后加入2ml  100mM  NaOH+0.5%Brij  35P轻柔吹吸混匀磁珠, 将磁珠置于磁力架上, 静置20s, 弃上清, 重复一 次; 将磁珠从磁力架上取下, 加入2mL的纯水, 轻柔吹吸混匀 磁珠, 将磁珠置于磁力架上, 静 置20s, 弃 上清, 重复两次加入1mL的0.1 ×TE, 获得具有分子随机 长片段核酸序列的磁珠。 2.根据权利要求1所述的一种偶联随机长片段核酸序列的磁珠制备工艺, 其特征在于: 所述第一段oligo(P1)、 第二段oligo(P2)和第三段oligo(P3)对应的序列分别为: 第一段 oligo(P1): CTACACGACGCTCTTCCGAT  CTB1~B1L1~L1, 其中B1, L1为A、 T、 C、 G任 一碱基,“~” 为4‑16个任意序列; 第二段oligo(P2): B 2~B2L2~L2, 其中B2, L2为A、 T、 C、 G任一碱基, “~” 为4‑16个任意序列; 第三段oligo(P3): B3~B3N~N 【TTT】 , 其中B3, N均为A、 T、 C、 G任一碱基, 且“~”为4‑16个任意序列, 【TTT】 为10 ‑30个T; 第一段辅助序列(R1)、 第二段辅助序列(R2)权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 114836519 A 2和第三段辅助序列(R3)分别为: 第一段辅助序列(R1): 部分前段序列和B1~B1的互补序列; 第二段辅助序列(R2): L1~L1B2~B2的互补序列; 第三段辅助序列(R3): L2~L2B3~B3的互 补序列; 且上述序列中P1、 P2、 P3三段中的B1~B1、 B2 ~B2、 B3~B3为 不同序列。 3.根据权利要求1所述的一种偶联随机长片段核酸序列的磁珠制备工艺, 其特征在于: 所述步骤(2)中退火互补成双链的方法为在PCR仪中进行反应, 反应程序为95℃5min, 0.05 ℃/s降至20℃, 20℃1mi n; 或Shaker:95℃5mi n, 55℃2h进行 连接。权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 114836519 A 3

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