(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210456185.1 (22)申请日 2022.04.27 (71)申请人 北京金豪制药股份有限公司 地址 102600 北京市大兴区北京经济技 术 开发区运成街7号1号楼 (72)发明人 王月华　黄玉超　 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 用于同时检测羊、 牛和猪的布鲁氏菌的组合 物、 试剂盒和方法 (57)摘要 本申请涉及一种用于同时检测羊、 牛和猪的 布鲁氏菌的组合物、 试剂盒和方法。 所述组合物 包括： 组分A： 用于检测羊布鲁氏菌的上游引物1、 下游引物1和荧光探针1， 其碱基序列分别如SEQ   ID NO.1‑3所示； 组分B： 用于检测牛布鲁氏菌的 上游引物2、 下游引物2和荧光探针2， 其碱基序列 分别如SEQ  ID NO.4‑6所示； 和组分C： 用于检测 猪布鲁氏菌的上游引物3、 下游引物3和荧光探针 3， 其碱基序列分别如SEQ  ID NO.7‑9所示。 利用 上述组合物能够同时对待测样 本中的羊、 牛和猪 的布鲁氏菌基因进行检测， 为布鲁氏菌病的流行 病学、 致病机理等相关领域的研究提供依据。 权利要求书2页 说明书10页 序列表2页 附图3页 CN 114934125 A 2022.08.23 CN 114934125 A 1.一种用于同时检测羊、 牛和猪的布鲁氏菌的组合物， 其特征在于， 所述组合物包括以 下组分： 组分A： 用于检测羊布鲁氏菌的上游引物1、 下游引物1和荧光探针1， 其碱基序列分别 为： 上游引物1： 5 ’ ‑CTGAAAGATGGTGCGCTG G‑3’； 下游引物1： 5 ’ ‑GAGATCGGAACGAGCGA AAT‑3’； 荧光探针1： 5 ’ ‑CCTATTTCTTTGTGGGCGGCTAT‑3’； 组分B： 用于检测牛布鲁氏菌的上游引物2、 下游引物2和荧光探针2， 其碱基序列分别 为： 上游引物 2： 5’ ‑CATGCGCTATGATCTG GTTACG‑3’； 下游引物 2： 5’ ‑TTCTATCACG GTATTCTACCATTG‑3’； 荧光探针2： 5 ’ ‑TGCAGACACGC CCTAGAACGCC‑3’； 组分C： 用于检测猪布鲁氏菌的上游引物3、 下游引物3和荧光探针3， 其碱基序列分别 为： 上游引物3： 5 ’ ‑TGGAGCAAACGCTGAAGC‑3’； 下游引物3： 5 ’ ‑CGGCTTGCGGCTAATATCT‑3’； 荧光探针3： 5 ’ ‑CCGGAACTCCTGACGCTCT ‑3’。 2.根据权利要求1所述的组合物， 其特征在于， 所述荧光探针1、 荧光探针2和荧光探针3 的5’端均标记有荧光报告基团， 3 ’端均标记有荧光淬灭基团； 且所述荧光探针1、 荧光探针2 和荧光探针3的5 ’端所标记的荧 光报告基团互不相同。 3.根据权利要求2所述的组合物， 其特征在于， 所述荧光探针1、 荧光探针2和荧光探针3 的5’端所标记的荧光报告基团分别 为FAM、 HEX和Cy5； 所述荧光探针1、 荧光探针2和荧光探 针3的3’端所标记的荧 光淬灭基团分别为BHQ1、 BHQ1和BHQ2。 4.一种用于同时检测羊、 牛和猪的布鲁氏菌的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包括如 权利要求1 ‑3中任意一项所述的组合物。 5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括： DNA聚合酶以及包含 dNTPs的反应液； 优选地， 所述DNA聚合酶为Taq酶。 6.一种利用如权利要求1 ‑3中任意一项所述的组合物或者权利要求4或5所述的试剂 盒 对待测样本中的羊、 牛和猪的布鲁氏菌进行同时检测的方法， 其包括如下步骤： S1， 将待测样本中所提取的DNA、 所述的组合物、 反应液和DNA聚合酶混合， 形成反应体 系； S2， 对所述反应 体系进行实时荧 光定量PCR扩增， 得到扩增曲线； S3， 对所述扩增曲线 进行分析， 并作出判断。 7. 根据权利 要求6所述的方法， 其特征在于， 步骤S1中， 所述反应体系为50uL， 具体为： 待测样本 中的DNA为10~15uL， DNA聚合酶为1.5~2.5uL (9~10U/uL)， 上游引物1、 上游引物2 和上游引物3各自独立的为1.2~2.5uL(9~10pmol/uL)， 下游引物1、 下游引物2和下游引物3 各自独立的为1.2~2.5uL(9~10pmol/uL)， 荧光探针1、 荧光探针2和荧光探针3各自独立的为 0.6~1.2uL(9~10pmol/uL)， 反应液为23~25uL和余 量的ddH2O。 8.根据权利要求6或7 所述的方法， 其特 征在于， 步骤S2中， 所述PCR的扩增条件为：权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114934125 A 290℃~95℃预变性1~3分钟； 90℃~95℃变性5~10秒， 50℃~60℃退火延伸3 0~50秒， 35~40个循环； 65~75℃延伸5~10分钟。 9.根据权利要求6或7所述的方法， 其特征在于， 步骤S3中， 对扩增曲线进行分析判断的 原则为： 当待测样本在荧光探针1上所标记的荧光报告基团的荧光通道中的Ct值≤35， 且所述 荧光通道的扩增曲线呈S形， 判断待测样本为羊布鲁氏菌阳性样本； 当待测样本在荧光探针1上所标记的荧光报告基团的荧光通道的扩增曲线不呈S形， 判 断待测样本为羊布鲁氏菌阴性样本； 当待测样本在荧光探针2上所标记的荧光报告基团的荧光通道中的Ct值≤35， 且所述 荧光通道的扩增曲线呈S形， 判断待测样本为牛布鲁氏菌阳性样本； 当待测样本在荧光探针2上所标记的荧光报告基团的荧光通道的扩增曲线不呈S形， 判 断待测样本为牛布鲁氏菌阴性样本； 当待测样本在荧光探针3上所标记的荧光报告基团的荧光通道中的Ct值≤35， 且所述 荧光通道的扩增曲线呈S形， 判断待测样本为猪布鲁氏菌阳性样本； 当待测样本在荧光探针3上所标记的荧光报告基团的荧光通道的扩增曲线不呈S形， 判 断待测样本为猪布鲁氏菌阴性样本 。 10.根据权利要求6或7所述的方法， 其特征在于， 所述方法还包括分别建立羊布鲁氏菌 核酸模板拷贝 数浓度的对 数‑Ct值的标准曲线、 牛鲁氏菌核酸模板拷贝 数浓度的对数 ‑Ct值 的标准曲线以及牛布鲁氏菌核酸模板拷贝数浓度的对数 ‑Ct值的标准 曲线， 以对待测样本 中的羊、 牛和猪的布鲁氏菌进行定量检测。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114934125 A 3