(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210447850.0 (22)申请日 2022.04.27 (71)申请人 江苏楠峰农业科技发展 有限公司 地址 225800 江苏省扬州市宝应 县安宜镇 泰山西路2号 (72)发明人 刘峰　 (74)专利代理 机构 南京德铭知识产权代理事务 所(普通合伙) 32362 专利代理师 陈亮 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 鉴定水稻稻瘟病抗性基因Pid3的KASP分子 标记方法及应用 (57)摘要 本发明涉及鉴定水稻稻瘟病抗性基因Pid3 的KASP分子标记方法及应用， 它用于检测水稻抗 稻瘟病广谱基因Pid3的KASP分子 标记及应用， 该 分子标记包括的SNP位点位于Pid3转录起始位点 开始的第22 08位核苷酸处， 分子标记多态性为C/ T， 针对该位点的碱基变异， 设计KASP标记引物， 对不同水稻的DNA样品进行荧光定量PCR扩增分 型； 本发明的KASP标记 检测Pid3基因位点特异性 高， 检测结果准确可靠， 而且能够实现对不同样 本材料的高通量检测， 与常规分子标记技术相比 具有快捷、 高效、 准确， 该KASP标记方法在育种中 能进一步提高对含Pid3抗病纯合基因型的选择， 以加快抗稻瘟病水稻品种的育种进程。 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 115074457 A 2022.09.20 CN 115074457 A 1.鉴定水稻稻瘟病抗性基因Pid3 的KASP分子标记方法， 其特征在于， Pid3基因KASP引 物序列为： 正向引物Pid3 ‑F‑5’CTTCTTGACTACTGTCTGC CTGG 3’ 正向引物Pid3 ‑H‑5’CTTCTTGACTACTGTCTGC CTGA 3’ 反向通用引物Pid3 ‑R‑5‘AGTTGTTCATGGCCATCACTA A 3’。 2.根据权利要求1所述的鉴定水稻稻瘟病抗性基因的Pid3的KASP分子标记方法， 其特 征在于， 合成权利要求1所述的Pid3基因KASP分子标记引物时， 所述正向引物Pid3 ‑F的5‘端 加上羧基荧光素FAM的荧光信号标签； 正 向引物Pid3 ‑H的5’端加上六氯荧光素氨基磷酸酯 HEX的荧光信号标签。 3.根据权利要求2所述的鉴定水稻稻瘟病抗性基因的Pid3的KASP分子标记方法， 其特 征在于： 包括 （1） 水稻植株 基因组DNA的提取； （2） 将权利要求2所述的Pid3基因KASP分子标记引物加入同一10.14  ul PCR反应体系， 并设置两个以双 蒸水代替样品模板DNA的空白对照， 在荧光定量PCR仪上对水稻种质资源或 育种群体植株的DNA进行扩增； （3） 数据分析在 Bio‑Rad CFX Manager 3.1 软件上进行。 4.根据权利要求3所述的鉴定水稻稻瘟病抗性基因的Pid3的KASP分子标记方法， 其特 征在于： 所述10.14  ul反应体系包括样品模板10  ng/ul的DNA  5.0 ul， 荧光引物mix  0.14 ul， 2×KASP Master mix 5.0 ul； 该反应条件包括94℃预变性15min； 94℃ 变性20sec， 61~55℃退火60sec， 每一个循环降 低0.6℃， 10个 循环； 94℃变性20sec， 5 5℃退火6 0sec， 26个 循环。 5.根据权利 要求3或4所述的鉴定水稻稻瘟病抗性基因的Pid3的KASP分子标记方法， 其 特征在于： 根据权利要求3中Bio ‑Rad CFX Manager 3.1软件数据分析图的颜色和位置进行 判别， 其中靠近Y轴的方点表示携带CC等位变异的不含Pid3抗性基因的纯合体； 靠近X轴的 圆点表示携带TT等位变异的含Pid3抗性基因的纯合体； 位于中间的三角点表 示携带CT的杂 合体； 红色X表示是以双蒸水代替样品模板DNA的空白对照。 6.权利要求1所述的鉴定水稻稻瘟病抗性基因Pid3的KASP 分子标记方法在含Pid3基因 抗稻瘟病水稻育种中的应用。 7.权利要求1所述的鉴定水稻稻瘟病抗性基因Pid3的KASP分子标记方法在水稻种质资 源改良中的应用。 8.权利要求1所述的鉴定水稻稻瘟病抗性基因Pid3的KASP分子标记方法在培育具有抗 稻瘟病能力水稻中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115074457 A 2鉴定水稻 稻瘟病抗性基因Pid3的KASP分子标记方 法及应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术工程领域 的鉴定水稻稻瘟病抗性基因Pid3的KASP分子标记 方法及应用。 背景技术 [0002]随着稻瘟病是由真菌(Magnaporthe  oryzae)引起的广泛发生在世界各稻区的主 要病害之一， 稻瘟病地理分布在全球所有的稻区(CAB  International，  1981， http:// www.cabi.org)， 发病后致使产量损失相当严重， 在丘陵地区甚至经常出现颗粒无收的现 象， 严重影响了人们的生活(Elsa  et al.， 2008)。 目前控制稻瘟病的主要方式是使用农药 和培育稻瘟病抗性品种。 在农药使用方面过多的使用不仅增加了水稻生产的成本， 还对环 境造成较大 的污染。 培育稻瘟病抗性品种 方面， 传统的遗传育种方法在提高水稻病害抗性 方面做出了重要贡献， 然而优质的感病品种相对而言， 所占比重较大， 育种周期 长而稻瘟病 菌生理小种变异快等， 在一定程度上说明了传统育种的不足， 然而随着分子生物学研究的 深入， 通过转基因和分子标记辅助选择(MarkAssistanceSelecting， MAS)  方法， 选育集高 产、 优质和多抗于一体的品种则可以弥补传统育种的不 足。 所以在生产上， 更多的稻瘟病抗 性基因的鉴定、 分离和克隆就显得 更加迫切 和必要。 [0003]Pid3源自籼稻品种“地谷”， 对我国稻瘟病生理小种表现较高的抗稻瘟病的能力。   亚洲栽培稻可分成籼、 粳两个亚种， 它们在抗稻瘟病方面表现出明显的差异， 但是造成这种 差异的分子基础还不清楚。 Shang  等(2009)在全基因范 围内对籼稻  93‑11 和粳稻日本晴 中的 NBS‑LRR 类的假基因成员进行了比较， 结果发现两个品种基因组中的假基因在结构 和分布上存在很大的差异， 根据这一结果Shang  等(2009)设计了大量的能特异性扩增日本 晴中 NBS‑LRR类假基因的分子标记， 这些标记与稻瘟病感病性状是共分离的， 因而可以用 来对由抗病籼稻和感病粳稻为父母本杂交获得的后代分离群体的抗、 感情况进行鉴定。 通 过这个办法， 在籼稻品种地谷中， 作者确定了新的抗稻瘟病基因  Pid3， 其cDNA  全长为  2970 bp， 含有 2 个外显子， 编码一个  由 923 氨基酸组成的蛋白产物， 造成抗感差异的原 因是由于Pid3在粳稻品种中转录起始 位点开始的第  2208 位核苷酸 C突变为 T， 这一突变 导致氨基酸的编码在  LRR 区提前终止， 只产生长737个氨基酸的蛋白产物。 [0004]传统稻瘟病抗性育种是在充分发病条件下根据植株表型进行选择， 这种方式不仅 耗时费力而且极易受环境干扰准确 性不高。 利用目标基因存在的碱基差异， 开发特异性分 子标记进行辅助选择是提高含Pid3基因抗稻瘟病水稻选择效率的最佳方法。 为提高Pid3基 因的选择效率， 已有研究者利用不同类型 的分子标记来鉴定其抗性基因型， 并筛选出一些 具有目标基因纯合的材 料。 然而， 这些标记在实际选择 过程中也 暴露出诸多问题。 [0005]KASP分型技术， 即竞争性等位基因特异性  PCR (Kompetitive  allele specific   PCR)， 是一种新的  SNP 检测方法， 具有广阔的应用前景(Steele  et al.， 2018)。 它可以在 更大范围的基因组  DNA 样本中准确地判断特定位点的  SNPs 和 InDels， 且耗时更短， 可 用于高通量分析(Priya  et al.， 2019)。 该技术在遗传图谱构建、 基因定位研究(Allen  et 说　明　书 1/4 页 3 CN 115074457 A 3