(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210444640.6 (22)申请日 2022.04.26 (71)申请人 武汉霆科生物科技有限公司 地址 430000 湖北省武汉市东西湖区柏泉 茅庙集街43号 (72)发明人 付新华　朱馨蕾　刘全　 (74)专利代理 机构 武汉泰山北斗专利代理事务 所(特殊普通 合伙) 42250 专利代理师 董佳佳 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种胸窗萤SSR分子标记及其引物组合和应 用 (57)摘要 本发明提供了一种胸窗萤SSR分子标记， 其 特征在于， 包括13组SSR分子标记中的一种或多 种， 所述13组SSR分子标记编号分别为： SSR308、 SSR311、 SSR313、 SSR319、 SSR320、 SSR323、 SSR324、 SSR325、 SSR405、 SSR406、 SSR501、 SSR503、 SSR504； 且所述13组SSR分子 标记位点的 核苷酸序列如SEQ  ID NO.1～13所示。 通过本发 明的胸窗萤SSR分子标记， 建立技术体系， 弥补了 胸窗萤特异性分子标记的空白， 可以用于萤火虫 子代父权、 遗传多样性、 群体遗传学及种质进行 鉴定分析， 结果可被用于萤科昆虫的性选择及进 化研究， 以及胸窗萤的人工饲养、 复育及保护的 评估。 权利要求书1页 说明书12页 序列表12页 附图2页 CN 114752687 A 2022.07.15 CN 114752687 A 1.一种胸窗萤SSR分子标记， 其特征在于， 包括13组SSR分子标记中的一种或多种， 所述 13组SSR分子标记编号分别为： SSR308、 SSR311、 SSR313、 SSR319、 SSR320、 SSR323、 SSR324、 SSR325、 SSR405、 SSR406、 SSR501、 SSR503、 SSR504； 且所述13组SSR分子标记位点的核苷酸序 列如SEQ ID NO.1～13所示。 2.用于扩增如权利要求1所述的胸窗萤SSR分子标记位点的引物组合， 其特征在于： 所 述SSR分子标记的正向引物组合的核苷酸序列如SEQ  ID NO.14～26所示， 反向引物组合的 核苷酸序列如SEQ  ID NO.27～39所示。 3.根据权利 要求2所述的胸窗萤SSR分子标记位点的引物组合， 其特征在于： 所述SSR分 子标记的引物组合设计的条件如下： 以被检测到的SSR上下游100bp侧翼序列进行引物设 计， 引物长度为20bp～28bp； 退火温度为60℃ ～65℃； 且每组引物的正向引物组合与反向引 物组合之间的退火温度差的最大值为1℃； 扩增序列时， 核心单位包含3 ‑5个碱基的串联重 复。 4.一种如权利要求1所述的胸窗萤SSR分子标记 的获得方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： S1胸窗萤基因 组DNA的提取和检测； S2对胸窗萤的基因组DNA样本进行PCR扩增： 反应体系为： ddH2O,5.28 μL； dNTP,0.8 μL； Buffer,1 μL； Mg2+,0.8 μL； BSA,0.2 μL； Primer  forward,0.2 μL； Primer  Reverse,0.2 μL； Taq, 0.2 μL； DNA模板,1μL； PCR扩增条件为94℃预变性5min； 94℃变性30sec； 60℃ 退火30sec， 72 ℃延伸30sec； 8个循环， 每循环降1℃； 然后94℃变性30sec； 60℃退火30sec； 72℃延伸 30sec； 27个 循环； 72℃延伸5mi n； 4℃保存， 得到PCR产物。 5.一种如权利要求1所述的胸窗萤SSR分子标记在萤火虫遗传分析或人工饲养中的应 用。 6.一种如权利要求2所述的胸窗萤SSR分子标记位点的引物组合在萤火虫遗传分析或 人工饲养中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114752687 A 2一种胸窗萤S SR分子标记及其引物组合和应用 技术领域 本发明涉及DNA分子标记技术领域， 具体涉及胸窗萤SSR分子标记， 尤其涉及一种 胸窗萤SSR分子标记及其引物组合和应用。 背景技术 简单重复序列(SSRs， SimpleSequenceRepeats)， 又叫做微卫星位点 (Microsatellites)， 是由1～6bp的重复单元串联重复而成的序列(Sh armaetal.2007)。 它 们在原核、 真核基因组中广泛分布， 在基因编码区及非编码区都能找到(Lietal.2004)。 作 为分子标记， SSR有许多优点： 在整个基因组中分布广泛、 均匀且数量充足， 因而多态性很 高； SSR标记呈孟德尔共显性遗传， 可以区分纯合、 杂合基因型； PCR扩增仅需要少量DNA， 且 对DNA的质量要求不高。 近年来还发现SSR在基因组中可能发挥着一些功能， 例如影响基因 调控、 基因组系统组成等。 因此从基因组水平上了解SSR的分布是非常重要的。 传统获得SSR 标记的方法需通过建立、 筛选基因组文库、 克隆测序、 引物设计等一系列实验， 耗费许多人 力、 物力。 而现在， 随着基因组测序越来越便捷， 由基因组数据中直接开 发SSR标记的方法也 被运用得越来越多。 胸窗萤(Pyrocoelia  pectoralis Olivier)普遍分布于中 国湖北省， 幼虫陆生。 成 虫性二型， 雌萤翅退化， 体型较雄萤大。 雌虫能与不同雄虫多次交配， 形成一雌多雄的交配 格局。 胸窗萤生活史存在一年生(以卵越冬， 生活史一年)和二年生(以10.67％越冬幼虫发 育形成的， 生活 史二年)， 是目前在萤火虫的研究中特殊的一个物种。 通过研究胸窗萤的SSR分子标记技术， 可以用于萤火虫子代父权、 遗传多样性、 群 体遗传学及种质进行鉴定分析， 同时可被用于萤科昆虫 的性选择及进化研究， 以及胸窗萤 的人工饲养、 复育及保护的评估， 然而， 到目前为止， 尚没有萤火虫SSR分子标记 开发的相关 报道。 发明内容 本发明提供的一种胸窗萤SSR分子标记及其引 物组合和应用， 旨在解决上述背景 技术中存在的问题。 为了实现上述 技术目的， 本发明主 要采用以下技 术方案： 一种胸窗萤SSR分子标记， 包括13组SSR分子标记中的一种或多种， 所述13组SSR分 子标记编号分别为： SSR308、 SSR311、 SSR313、 SSR319、 SSR320、 SSR323、 SSR324、 SSR325、 SSR405、 SSR406、 SSR501、 SSR503、 SSR504； 且所述13组SSR分子标记位点的核苷酸序列如SEQ   ID NO.1～13所示。 具体的， SSR308由SEQ  ID NO.1所示的核苷酸序列组成， SEQ  ID NO.1的核苷酸序 列为： ATTTCAAATCTCAAACTTTATTGTTTTCAAAATAAAAATGATACAAAATCTAACTGCAAATAGGAATT TCAGACCAAATCGATTATTTTTGTTACAACAATAACACTATTTTTTTTTATTTTTGTTGCTTTTTCGAA GTCATTT说　明　书 1/12 页 3 CN 114752687 A 3