(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210436554.0 (22)申请日 2022.04.25 (71)申请人 陕西科技大 学 地址 710021 陕西省西安市未央大 学城 (72)发明人 徐秦峰　贺晓玲　蒲改平　王芳　 刘楠　杨雨昕　 (74)专利代理 机构 西安新思维专利商标事务所 有限公司 61 114 专利代理师 李罡 (51)Int.Cl. C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/6876(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种DNA长度的熔解测定方法及试剂盒 (57)摘要 本发明为一种DNA长度的熔解测定方法及试 剂盒， 其克服了现有技术中存在的当目标DNA的 熔解温度相近时， 无法依据熔解温度区分多个目 标DNA的问题。 本发明测定方法更加简单快速， 可 广泛用于基于核酸分析的食品真实性鉴定、 医疗 诊断等领域， 具有较强的实际应用价值。 本发明 通过加入小分子季铵盐消除GC含量对熔解温度 的影响， 建立了荧光标记和非标记 荧光熔解测定 DNA长度的两种方法。 利用加入以上3种添加剂后 的熔解温度以及计算得到GC％两种方式测定未 知DNA的长度。 实现了DNA水解切割反应监测的应 用， 并将多重PCR和熔解测定长度方法结合检测 了乳及乳制品中牛、 山羊、 绵羊三种动物源性成 分。 权利要求书2页 说明书11页 附图13页 CN 114774526 A 2022.07.22 CN 114774526 A 1.一种DNA长度的熔解测定方法， 其特 征在于： 包括以下步骤： 1)通过对DNA样品加入四甲基 氯化铵或四乙基氯化铵或甜菜碱小分子季铵盐消除GC含 量对熔解温度的影响； 2)建立不同添加剂对应的熔解温度和长度的标准曲线以及GC含量和加与不加添加剂 的熔解温度差的标准曲线； 3)对于未知长度的DNA加入四甲基氯化铵或四乙基氯化铵或甜菜碱添加剂进行熔解， 读取对应熔解温度带入两种标准曲线计算DNA长度； 4)对于DNA酶水解反应产物长度的测定， 将四甲基氯化铵或四乙基氯化铵或甜菜碱添 加剂加入DNA酶水解反应产 物中， 读取对应熔解 温度带入两种标准曲线计算DNA水解产 物长 度； 5)对于PCR产物长度的测定通过设计对应PCR引物获得扩增子， 将四甲基氯化铵或四乙 基氯化铵或甜菜碱添加剂加入P CR产物中， 读取对应熔解 温度带入两种标准曲线计算P CR产 物长度； 6)对于多重PCR产物区分及实际样品的检测， 通过对比核苷酸序列及特异性检验， 设计 多对特异性PCR引物， 对单重、 双重及三重PCR扩增产物加入四甲基氯化铵或四乙基氯化铵 或甜菜碱添加剂进行 熔解区分。 2.根据权利 要求1所述的一种DNA长度的熔解测定方法， 其特征在于： 步骤1)中， 通过荧 光标记和非标记荧 光两种方式监测熔解曲线的形成， 读取对应熔解温度。 3.根据权利 要求1所述的一种DNA长度的熔解测定方法， 其特征在于： 步骤2)中， 利用熔 解温度或者GC含量任意 一种方法计算DNA长度。 4.根据权利 要求1所述的一种DNA长度的熔解测定方法， 其特征在于： 步骤3)中， 通过加 入四甲基氯化铵、 四乙基氯化铵、 甜菜碱添加剂中的任意 一种进行 熔解测定DNA长度。 5.根据权利 要求1所述的一种DNA长度的熔解测定方法， 其特征在于： 步骤5)中， 用于扩 增山羊DNA的特异性引物对为Primer1、 扩增牛DNA的特异性引物对为Primer2、 扩增绵羊DNA 的特异性引物对为Primer3； 所述引物对Primer1的序列为： 上游引物： 5' ‑GGGGGGGGGGGCCATAATTACAACAA‑3' 下游引物： 5' ‑CCCTATCAGCTGCAGTAG GGTT‑3' 引物对Primer 2的序列为： 上游引物： 5' ‑AGTAAGCGTAATTATGATAC ‑3' 下游引物： 5' ‑CCCCCTTGATTCTCTTGGTGTAGAG ‑3' 引物对Primer3的序列为： 上游引物： 5' ‑CGTAGATGTAGTATGACT TTTCCT‑3' 下游引物： 5' ‑GTGAAGTTAGTTAGGAGAGTAATTATA‑3'。 6.根据权利要求1所述的一种DNA长度的熔解测定方法， 其特征在于： 步骤1)、 步骤3)、 步骤4)、 步骤5)中， 荧光标记的熔解体系为： 1μL合成DNA或PCR扩增产物， 6mM  Mg2+， 10mM  HEPES及1～3M四乙基氯化铵或4～6M甜菜碱或2～4M四甲基氯化铵， 无添加剂组用超 纯水代 替； 非标记荧光标记熔解体系为： 1μL合成DNA或PCR扩增产物， 6mM  Mg2+， 10mM HEPES(pH   7.9)， 0.5 ×或2×DNA结合染料及1～3M四乙基氯化铵或4～6M甜菜碱或2～4M四甲基氯化权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114774526 A 2铵， 无添加剂组用超纯 水代替； 高分辨熔解 程序为37～ 99℃， 熔解速率 为0.05℃/s。 7.根据权利要求1所述的一种DNA长度的熔解测定方法， 其特征在于： 步骤4)中， PCR反 应体系组成为： 50nM的正向引物和反向引物， 1 ×Taq PCR Master Mix， 2ng/ μL的PCR纯化产 物， 最后用双蒸水补足10 μL反应体系， 并用双蒸水作为阴性对照,； PCR扩增的反应程序为： 94℃预变性5mi n； 94℃变性15s， 57℃退火20s， 72℃延伸3 0s， 25个循环； 72℃延伸5mi n。 8.根据权利要求1所述的一种DNA长度的熔解测定方法， 其特征在于： 步骤5)中， PCR反 应体系组成为： 引物对Primer1： Primer2： Primer3的引物浓度比为9:3:5， 1 ×QIAGEN  Multiplex PCR Master Mix， 0.5×DNA结合染料， 2 0ng/ μL的DNA， 最后用双蒸水补足10 μL 反 应体系， 并用双蒸水作为阴性对照,； PCR扩增程序为： 94℃预变性10min； 94℃、 15s变性， 57 ℃、 60s退火及延伸， 设置25次循坏； 72℃再延伸5mi n， 每次循环的延伸阶段收集 荧光信号。 9.根据权利 要求1所述的一种DNA长度的熔解测定方法， 其特征在于： 步骤5)中， 实际样 品采集自新鲜乳、 乳制品或其他基因样品， 经对比参考样品和待测样品熔解峰的位置进行 鉴定检测。 10.一种DNA长度的熔解测定试剂盒， 其特征在于： 该试剂盒含有用于建立添加剂熔解 体系的四甲基氯化铵或四乙基氯化铵或甜菜碱添加剂、 DNA结合染料、 1 ×的反应buffer： 6mM Mg2+和10mM HEPES以及进行长度测定的不同添加剂对 应的熔解温度和长度的标准曲线 以及GC含量和 加与不加添加剂的熔解温度差的标准曲线图。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114774526 A 3