(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210440506.9 (22)申请日 2022.04.25 (71)申请人 南昌大学第一附属医院 地址 330006 江西省南昌市永外正 街17号 (72)发明人 张伟　刘洋　许恒毅　邓梅　徐倩　 熊琴　孔蕴源　程南燕　牟丹　 (74)专利代理 机构 北京慕达星云知识产权代理 事务所 (特殊普通合伙) 11465 专利代理师 魏志恒 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种新型冠状病毒检测试剂盒及基于磁珠 富集结合RPA的检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种新型冠状病毒检测试剂 盒及基于磁珠富集结合RPA的检测方法， 涉及病 毒检测技术领域。 具体通过硅基磁珠实现对目标 病毒核酸的提取， 进一步进行 RPA反应， 得到大量 的核酸， 最后通过荧光检测， 实现对新型冠状病 毒COVID‑19的检测。 本发明检测方法具有方便、 特异性强、 灵 敏度高的优点， 与RT ‑PCR相比， 大大 缩短了检测时间， 实现高效快速检测新型冠状病 毒的目的。 权利要求书2页 说明书5页 序列表1页 附图2页 CN 114686621 A 2022.07.01 CN 114686621 A 1.一种新型 冠状病毒检测试剂盒， 其特 征在于， 包括以下引物对和探针： 上游引物F： 5 ’ ‑CCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCA AC‑3’， SEQ ID NO.1； 下游引物R： 5 ’ ‑AGTGACAGT TTGGCCTTGTTGTTGTTGGCCTT‑3’， SEQ ID NO.2； 探针P： 5’ ‑TAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCT TGCTTTGCTGCTGCT T‑3’， SEQ ID NO.3， 所述探针P采用荧光淬灭基团和荧光报告基团进行修饰， 荧光淬灭基团修饰在探针序 列离5’端碱基数28bp的位置上； 荧光报告基团修饰在探针序列离5 ’端碱基数33bp的位置 上， 荧光淬灭基团与报告基团之间间隔4个碱基GCTT， 其中离5 ’端碱基数30bp的位置上的C 用四氢呋喃残基替换； 3 ’端采用磷酸盐修饰用以阻断链的延伸。 2.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特 征在于， 还 包括： Buf fer C、 Buffer D和ddH2O； 所述Buffer  C为50mM Tris pH 8.4、 80mM乙酸钾、 2mM  DTT、 3mM ATP、 200μM  dNTPs、 20mM磷酸肌酸、 10 0ng/ μL肌酸激酶和5％聚乙二醇20 M； 所述Buffer D为20mM乙酸镁。 3.根据权利要求2所述的试剂盒， 其特征在于， 总体积50μL， 包括2μL上游引 物F、 2μL下 游引物R、 0.6 μL探针P、 2 9.4 μL Buffer C、 2.5 μL Buffer D、 ddH2O和模板13.5 μL； 且， 所述上游引物F、 下游引物R和探针P的浓度均为10 μM 。 4.一种基于磁珠富集结合RPA 的非诊断治疗目的的新型冠状病毒检测方法， 其特征在 于， 利用权利要求1 ‑3任一所述的试剂盒。 5.根据权利要求 4所述的检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)富集核酸： 采集样本， 加入离心管中， 再加入BufferA和硅基磁珠， 置于混匀仪上混 匀3min， 静置5‑10min， 离心后， 磁分离 3min后去上清； 再加入Buf fer B， 置于混匀仪上混匀后， 磁分离 3min后去上清液； 再加入Wash  Buffer， 置于混匀仪上混匀， 磁分离1mi n后去上清液； 离心管于20～ 25℃敞口放置10 ‑15min； 往离心管中加入20 μL  ddH2O重悬， 于混匀仪上混匀， 离心将反应液甩至管底后， 于65℃ 水浴10mi n， 磁分离 30s， 得到纯化的核酸模板； (2)RPA检测： 向干粉反应管中加入Buffer  C； 然后加入上游引物F、 下游引物R和探针P； 再依次加入ddH2O和步骤(1)所得核酸模板； 最后加入Buffer  D， 上下颠倒甩动反应管进行 混匀； 离心将反应液 甩至管底， 立即放入荧 光检测设备中， 42℃反应20mi n， 采集并分析 结果。 6.根据权利要求5所述的检测方法， 其特征在于， 所述Buffer  A为118.16g异硫氰酸胍 盐、 0.2M EDTA pH 8.0和100mL  0.1M Tris‑HCl pH 6.5； Buffer  B为1.477g异硫氰酸胍盐、 100mL 0.1M Tris‑HCl pH 7.5和150mL无水乙醇； Wash Buffer为乙醇， 浓度为70％vo l； Buffer C为50mM Tris pH 8.4、 80mM乙酸钾、 2mM  DTT、 3mM ATP、 200 μM  dNTPs、 20mM磷 酸肌酸、 10 0ng/ μL肌酸激酶和5％聚乙二醇20 M； Buffer D为20mM乙酸镁。 7.根据权利要求5所述的检测方法， 其特征在于， 步骤(1)所述硅基磁珠表面修饰硅羟 基， 且粒径大于1 μm。 8.根据权利要求5所述的检测方法， 其特征在于， 步骤(1)所述磁分离的磁场强度为权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114686621 A 20.4T。 9.根据权利要求5所述的检测方法， 其特征在于， 步骤(2)所述Buffer  C添加量29.4 μL， 所述上游引物F添加量2 μL、 所述下游引物R添加 量2 μL、 所述探针P添加 量0.6μL， 所述ddH2O 添加量11.5 μL， 所述核酸模板添加量2 μL， 所述Buf fer D添加量2.5 μL， 且， 所述上游引物F， 所述下游引物R和所述探针P的浓度为10 μM 。 10.根据权利 要求5所述的检测方法， 其特征在于， 步骤(2)采集的是475nm的荧光值， 且 每隔30s采集一次。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114686621 A 3