(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210454897.X (22)申请日 2022.04.24 (71)申请人 云南农业大 学 地址 650000 云南省昆明市盘龙区金黑公 路95号 (72)发明人 李小兵　尹革芬　赵谦　毕峻宇　 刘应华　刘霄　 (74)专利代理 机构 昆明合众智 信知识产权事务 所 53113 专利代理师 张玺 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种PoSaV GIII型毒株全基因组扩增引物 及其扩增方法 (57)摘要 本发明公开了一种PoSaV  GIII型毒株全基 因组扩增引物及其扩增方法， 1)RNA提取， 2)全基 因分段扩增， 3)病料样本测序， 4)全基因序列分 析， 分析出病料样本的遗传变异特征； 本发明为 PoSaV疫苗的研制提供了研究基础， 有效预防和 控制该病在地 域的流行提供了科 学依据。 权利要求书2页 说明书7页 附图2页 CN 114774586 A 2022.07.22 CN 114774586 A 1.一种PoSaV  GIII型毒株全基因 组扩增引物， 其特 征在于， 包括8对 扩增引物： 引物对1： SaV‑F1： 5’ ‑TCGTGATG GCTAATTGCCGTC‑3’； SaV‑R1： 5’ ‑GCCATGTGGATAGTGGAYTA‑3’； 引物对2： SaV‑F2： 5’ ‑CCCACYCAAATGTTCACCAAG‑3’； SaV‑R2： 5’ ‑ATGTGTCAGTCA ACAAYCTCCT‑3’； 引物对3： SaV‑F3： 5’ ‑TGGCTTTYTGGCGTCGCATA AC‑3’； SaV‑R3： 5’ ‑TGGTGGGACATYCTCAARGC‑3’； 引物对4： SaV‑F4： 5’ ‑GGTTYCCYTTGCAGTCTGAGTG ‑3’； SaV‑R4： 5’ ‑GATTGCCAAYAACCTRCAACC‑3’； 引物对5： SaV‑F5： 5’ ‑TCMCAACACCARATGAT TGCC‑3’； SaV‑R5： 5’ ‑TCATGCCBGTGGTGGTYAA‑3’； 引物对6： SaV‑F6： 5’ ‑CACACAATCATCCCCRTATGTG ‑3’； SaV‑R6： 5’ ‑TTCACCCTGCTCAAGCCYCC‑3’； 引物对7： SaV‑F7： 5’ ‑TTGGRTTCACCCTGCTCAAGCC‑3’； SaV‑R7： 5’ ‑CACGATGAGT TGGATYGCAG G‑3’； 引物对8： SaV‑F8： 5’ ‑TGGGACAWCAG GAAGGTCCAT‑3’； SaV‑R8： 5’ ‑CCTTACACAGTGTG GCGGCT‑3’。 2.一种PoSaV  GIII型毒株全基因 组扩增方法， 其特 征在于， 包括下列步骤： 1)RNA提取， 将病料样本按照试剂盒操作说明进行反转录； 2)全基因分段扩增， 将反转录产物用8对扩增引物分别 扩增病料样本的全基因序列， 将 PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测； 3)病料样本测序， 将通过琼脂糖凝胶电泳检测的产物切胶， 进行胶回收， 胶回收产物连 接到pMD‑18T载体， 连接产物 转化到感受态细胞DH5α， 挑取单个菌落接种到氨 苄青霉素的LB 液体培养基中， 37℃恒温振 荡培养16 ‑18h， 按质粒提取试剂盒操作说明提取重组质粒， 将提 取好的重组质粒进行测序； 4)全基因序列分析， 用DNA  MAN 6.0将测序结果依次拼接得到病料样本 的全基因组序 列， 全基因序列在NCBI中比对分析， 应用DNAStar  7.1与MEGA  5.2软件将病料样本全基因组 序列与GenBank中公布的23株不同SaV流行毒株基因序列进行比对及遗传特征分析， 分析出 病料样本的遗传变异特 征。 3.如权利 要求2所述的一种PoSaV  GIII型毒株全基因组扩增方法， 其特征在于： 所述步 骤1)中反转录为 反转录体系10 μL： RNA模板3.5 μL， Easyscrip t RT/RI Enzyme MIX 5 μL， 2×权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114774586 A 2Es Reaction  MIX 0.5 μL,下游引物1μL； 反转录程序： 42℃30min， 85℃5min， 反转录产物置 于‑20℃保存。 4.如权利 要求2所述的一种PoSaV  GIII型毒株全基因组扩增方法， 其特征在于： 所述步 骤2)中PCR扩增体系2 5 μL： DNA模板1 μL， 上游引物10pmol/ μL与下游引物10pmol/ μL各0.5 μL， 2×TranTaq HiFi PCR Super MixⅡ12.5 μL， DEPC水10.5 μL。 5.如权利 要求2所述的一种PoSaV  GIII型毒株全基因组扩增方法， 其特征在于， 步骤2) 中PCR扩增程序： 94℃预变性5min， 94℃变性30s， 60℃退火60s， 72℃延伸60s， 共35个循环， 72℃延伸5mi n， 4℃低温保存。 6.如权利 要求2所述的一种PoSaV  GIII型毒株全基因组扩增方法， 其特征在于： 所述步 骤2)中将PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114774586 A 3