(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221043407 7.4 (22)申请日 2022.04.24 (66)本国优先权数据 202110446990.1 2021.04.25 CN (71)申请人 中国水产科 学研究院南海水产研究 所 地址 510300 广东省广州市海珠区新港西 路231号 (72)发明人 张殿昌　朱克诚　刘宝锁　何佩莹　 江世贵　郭华阳　张楠　郭梁　 (74)专利代理 机构 广州知友专利商标代理有限 公司 44104 专利代理师 宣国华　刘艳丽 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种与卵形鲳鲹抗刺激隐核虫病相关性状 的SNP分子标记及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种与卵形鲳鲹抗刺激隐核 虫病相关性状的SNP分子标记， 该SNP分子标记由 卵形鲳鲹LAAO基因中克隆得到， 位于LAAO基因外 显子中， 该分子 标记的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 1所示， 在该序列的6499位和6535位碱基处分别 存在两个等位基因突变(C/T)和(G/A)， 还公开了 用于扩增SNP分子标记的引物， 以及上述SNP分子 标记或引物在鉴别或选育抗刺激隐核虫病卵形 鲳鲹品种方面的应用。 本发明筛选的分子标记对 卵形鲳鲹抗刺激隐核虫病性状进行了关联分析， 本发明的两个标记可应用于以抗病性状为目标 的卵形鲳鲹育种材料早期筛选， 能够有效提高育 种的效率和缩短育种年限。 权利要求书1页 说明书9页 序列表5页 附图2页 CN 115011701 A 2022.09.06 CN 115011701 A 1.一种与卵形鲳鲹抗刺激隐核虫病相 关性状的SNP分子标记， 其特征是： 所述SNP分子 标记为SNP6499或SNP6535， 所述SNP6499位于LAAO基因如SEQ  ID NO： 1所示的碱基序列自5 ’ 端起的第6499位， 其碱基为C或T， 所述SNP6535位于LAAO基因如SEQ  ID NO： 1所示的碱基序 列自5’端起的第6 535位， 其碱基为G或A。 2.根据权利要求1所述的SNP分子标记， 其特征是： 第6499位的TT基因型个体比CC基因 型个体更加抗感， 即第6499位的TT基因型个体的抗刺激隐核虫病能力高于CC基因型个体； 第6535位的AA基因型个体比GG基因型个体更加抗 感， 即第6535位的AA基因型个体的抗刺激 隐核虫病能力高于G G基因型个 体。 3.用于扩增权利 要求1所述SNP 分子标记的引物， 其特征是： 所述引物为引物对SNP6499 或SNP6535， 所述引 物对SNP6499的上、 下游引 物的碱基序列分别如SEQ  ID NO： 2和SEQ  ID  NO： 3所示， 所述引物对SNP6535的上、 下游引物的碱基序列分别如SEQ  ID NO： 4和SEQ  ID  NO： 5所示。 4.权利要求1或2所述的SNP分子标记或权利要求3所述的引物在鉴别或选育抗刺激隐 核虫病卵形鲳鲹品种方面的应用。 5.权利要求2所述的SNP分子标记的获取 方法， 其特 征是包括以下步骤： (1)提取卵形鲳鲹个 体的基因 组DNA； (2)根据卵形鲳鲹LAAO基因组序列， 设计权利要求3所述引物对SNP6499或引物对 SNP6535， 进行PCR扩增； (3)扩增后使用琼脂糖凝胶电泳检测， 对凝胶图中有均一条带的样品进行测序， 根据测 序峰图判断潜在的SNPs位 点； (4)对SNPs位点进行基因分型， 发现LAAO基因的外显子存在两个SNP位点， 分别将其命 名为SNP649 9位点和SNP6 535位点。 6.一种抗刺激隐核虫病卵形鲳鲹的鉴别方法， 其特 征是包括以下步骤： (1)提取卵形鲳鲹的基因 组DNA； (2)采用权利要求3中的引物对SNP649 9或引物对SNP6 535进行PCR扩增， 获得PCR产物； (3)对扩增后产物进行基因分型， 对SNP位点的基因型和等位基因的频率分布进行统 计， 再对SNP位点与抗刺激隐核虫性状的关联度进行检验， 得出两者间是否存在显著性差 异。 7.根据权利要求6所述的鉴别方法， 其特征是： 步骤(3)中利用Excel  2016对SNP位点的 基因型和等位基因的频率分布进行统计， 再采用SPSS  Statistics  17.0软件对SNP位点与 抗刺激隐核虫性状的关联度进行卡方检验， 得 出两者间是否存在显著性差异。 8.根据权利 要求6所述的鉴别方法， 其特征是： 步骤(3)中SNP6499位点的TT基因型个体 比CC基因型个体更加抗感(P<0.05)， SNP6535位点的AA基因型个体比GG基因型个体更加抗 感(P<0.05)。 9.根据权利 要求6所述的鉴别方法， 其特征是： 步骤(3)中SNP6499位点的TT基因型个体 和SNP6535位点的AA基因型个 体为抗刺激隐核虫病卵形鲳鲹品种。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115011701 A 2一种与卵形鲳鲹抗刺激隐核虫病相关性状的SNP分子标记及 其应用 技术领域 [0001]本发明属于鱼类遗传育种分子标记辅助育种技术领域， 具体涉及一种与卵形鲳鲹 抗刺激隐核虫病相关性状的SNP分子标记及其应用。 背景技术 [0002]卵形鲳鲹(Trachinotus  ovatus)在分类学上隶属于鲈形目(Perciformes)、 鲹科 (Carangidae)、 鲳鲹属(Trachinotus)， 俗称金鲳、 黄腊鲳、 短鲳鲹等， 主要分布于我国南方 海域。 卵形鲳鲹肉质厚实细嫩， 味道鲜美， 生长速度快， 是兼具营养价值和经济价值的可食 用海水硬骨鱼类。 但由于养殖密度过大、 海域水质恶化等因素的影响， 卵形鲳鲹养殖海域会 爆发各种病害从而导致巨大的经济损失， 而刺激隐核虫(Cryptocaryon  irritans)病就是 对卵形鲳鲹养殖业造成严重影响的病害之一， 被刺激隐核虫感染的卵形鲳鲹死亡率极高， 因此， 研究如何提高卵形鲳鲹对刺激隐核虫的抗 性十分必要。 [0003]近年来， 由于环境污 染、 病害频发等导致卵形鲳鲹自然种群严重衰退， 种质严重退 化等； 同时卵形鲳鲹养殖群体的近亲繁殖、 小规格亲本人工育苗等原因， 导致卵形鲳鲹养殖 种质严重退化， 抗病力减弱， 养殖性能下降等。 以上问题严重制约了卵形鲳鲹养殖业的持续 健康发展， 因此卵形鲳鲹的良种选育工作亟需开展。 分子标记辅助选择育种 是良种选育的 方法之一， 与目标性状基因紧密连锁的分子标记可以用来对目标性状进行关联分析， 可以 明确候选的分子标记与个 体表型间的紧密关联， 进一 步缩短育种年限。 [0004]单核苷酸多态性(Single  Nucleotide Polymorphism， SNP)是一种遗传标记， 因其 具有数量多分布广、 富有代表性、 遗传稳定性高、 易于实现自动化分析的特点， 被看作最具 发展潜力的分子标记。 SNP的应用也十 分广泛， 可用于遗传图谱构建、 性状基因关联性分析、 种质鉴定和亲缘关系分析、 辅助育种等方面， 其中SNP与性状基因关联性分析不仅可以揭示 SNP与基因性状之间的联系， 还可以根据SNP位点和实际的育种需求进行分子育种， 益处良 多。 朱克诚等人对卵形鲳鲹MHC Ⅱβ 基因与美人鱼发光杆菌易感性/抗感性的多态性进行分 析， 发现卵形鲳鲹MHC Ⅱβ 基因中TO ‑DAB‑04， TO‑DAB‑05和TO‑DAB‑10这3个多态性位点与对 美人鱼发光杆菌易感性显著相关， TO ‑DAB‑01位点与对美人鱼发光杆菌抗感性具有显著关 联性， TO‑DAB‑01位点可以为 抗病育种实际应用提供参 考。 [0005]目前在卵形鲳鲹抗刺激隐核虫病遗传育种方面开展的工作较少， SNPs具有高多态 性， 分布广泛等众多优点， 在鱼类遗传育种中具有广泛的应用前景。 目前， 还未见与卵形鲳 鲹抗刺激隐核虫病性状相关的基因位 点的报道。 发明内容 [0006]本发明的目的在于提供一种与卵形鲳鲹抗刺激隐核虫病相关性状的SNP分子标记 以及用于扩增所述SNP分子标记的引物。 [0007]本发明目的还在于上述的SNP分子标记或上述的引物在鉴别或选育抗刺激隐核虫说　明　书 1/9 页 3 CN 115011701 A 3