(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210431086.8 (22)申请日 2022.04.22 (71)申请人 西南大学 地址 400700 重庆市北碚区天生路2号 (72)发明人 刘列钊　王嘉　林呐　周清元　 曲存民　 (74)专利代理 机构 成都为知盾专利代理事务所 (特殊普通 合伙) 51267 专利代理师 杨宜付 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) A01H 1/04(2006.01) A01H 1/02(2006.01) (54)发明名称 分子标记引物对、 耐旱型甘蓝型油菜鉴定方 法和育种方法 (57)摘要 本发明公开一种分子标记引物对、 耐旱型甘 蓝型油菜鉴定方法和育种方法， 所述分子标记引 物对为dCAPS标记引物对， 和/或， 基于巢式PCR的 位点特异性标记的外引物对和内引物对。 利用前 述分子标记引物对对甘蓝型油菜的DNA进行PCR 扩增， 电泳检测， 根据电泳条带的显示结果鉴定 甘蓝型油菜品种耐旱性， 将鉴定出的纯合耐旱型 甘蓝型油菜用于油菜新品种育种。 本发明基于全 基因组关联分析、 单倍型分析、 启动子截短和GUS 活性检测技术， 开发靶向明确的位点特异性标记 和dCAPS标记， 本发明提供的巢式PCR标记特异性 高， 可区分出耐旱 性更强的Hap4材 料。 权利要求书2页 说明书9页 序列表2页 附图4页 CN 114672584 A 2022.06.28 CN 114672584 A 1.一种用于鉴定甘蓝型油菜耐旱性的分子标记引物对， 其特征在于， 所述分子标记引 物对为dCAP S标记引物对， 碱基序列如下： SWU_YA7dCAP SF： CTACCCATATCCAGATCCTTACTACAGACGTAC； SWU_YA7dCAP SR： CTTTGCTCTGGATTGCCTACGTCTCAGTA。 和/或， 还 包括基于巢式PCR的位 点特异性标记的外引物对和内引物对。 2.根据权利要求1所述分子标记引物对， 其特 征在于， 所述外引物对的碱基序列如下： 正向外引物SWU_YA7 F： GTAGAG GTAGACCCGTAGAAAGCCG； 反向外引物SWU_YA7R： GACTCATGAGCAGCT TTAAATGTCC。 3.根据权利要求1所述分子标记引物对， 其特征在于， 所述内引物对包括第 一内引物对 和第二内引物对； 第一内引物对碱基序列如下： 第一正向内引物SWU_H 3F： GTAGCG GGTAGAGGTAGAC； 第一反向内引物SWU_H 3R： CAGAATTATCAAAATCCAAT； 第二内引物对碱基序列如下： 第二正向内引物SWU_H4F： GTAGCG GGTAGAGGTAGAC； 第二反向内引物SWU_H4R： CAGA ATTATCAAAATCCCAC。 4.一种基于权利要求1～3任一项所述分子标记引物对鉴定甘蓝型油菜品种耐旱性的 方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： S1.1提取一个或多个甘蓝型油菜品种的植株DNA； S1.2使用权利要求1所述dCAP S标记引物对， 进行第一PCR扩增， 得第一PCR扩增产物； S1.3用限制性内切酶 酶切所述第一PCR扩增产物， 进行酶切扩增多态性分析； S1.4将S1.3酶切所 得片段进行第一电泳检测； 第一电泳检测条 带以高带 呈现的甘蓝型油菜品种为耐旱品种； 第一电泳检测条 带以低带 呈现的甘蓝型油菜品种为 不耐旱品种。 5.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述限制性内切酶为限制性内切酶 Pfl23II。 6.根据权利要求 4所述的方法， 其特 征在于， 还 包括如下步骤； S2.1步骤S1.4后提取耐旱品种DNA； 或者， 重新提取一个或多个甘蓝型油菜品种的植株 DNA， S2.2利用所述外引物对 对所述S2.1提取的DNA进行第二PCR扩增， 得第二PCR扩增产物； S2.3取第二PCR扩增产物， 加ddH2O稀释后作为第三PCR扩增模板， 利用所述内引物对对 所述模板进行第三PCR扩增， 得第三PCR扩增产物； S2.4将所述第三PCR扩增产物进行第二电泳检测， 检查第二电泳条 带； 经S1鉴定为耐旱品种， 且检查S2.4第二电泳条 带： 第一内引物对无 条带且第二内引物对有条 带， 甘蓝型油菜品种为耐旱品种； 第一内引物对有条 带且第二内引物对无 条带， 甘蓝型油菜品种为 不耐旱或低抗品种。 7.一种耐旱型甘蓝型油菜育种方法， 其特征在于， 利用权利要求4～6任一项所述方法 选择出BnaA9.NF ‑YA7基因中的SNP基因型为胞嘧啶(C)同时启动子中靠近翻译起始位点的 CCAAT‑box缺失的甘蓝型油菜， 即为筛选出的目标株系， 对所述目标株系执行回交转育程权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114672584 A 2序。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 利用所述分子标记引物组合在甘蓝型油菜 苗期鉴定植株的基因型， 选取 纯合子基因型耐旱型或强耐旱型植株， 执 行回交转育程序。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114672584 A 3