(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210427634.X (22)申请日 2022.04.22 (71)申请人 佛山科学技术学院 地址 528000 广东省佛山市禅城区江湾一 路18号 (72)发明人 郭銮英　卢浩彤　金咤　陈美伊　 刘全　 (74)专利代理 机构 广州新诺专利商标事务所有 限公司 4 4100 专利代理师 刘婉　林玉芳 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6848(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 用于检测广东蜱夸兰菲尔病毒的引物对、 检 测试剂盒及巢式PCR检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种用于同时检测广东蜱夸 兰菲尔病毒三个基因的引物对， 所述引物对包括 一条上游引物和一条下游引物， 所述上游引物的 核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 所述下游引 物 的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示。 本发明还提 供了一种检测试剂盒， 其包括所述引物对。 本发 明还提供了一种同时检测广东蜱夸兰菲尔病毒 三个基因的巢式PCR检测方法， 该方法包括以下 步骤： 1)提取携带广东 蜱夸兰菲尔病毒的蜱的样 品RNA； 2)设计并合成PCR引物对； 3)以样品RNA为 模板， 进行巢式PCR扩增； 4)将PCR产物进行琼脂 糖凝胶电泳检测。 本发明可以同时扩增GT QV三个 不同功能基因， 一条电泳道能同时呈现三条长度 不同、 清晰不重合的特异性条带， 实现一引物多 功能的高效检测。 权利要求书1页 说明书15页 序列表7页 附图1页 CN 115109869 A 2022.09.27 CN 115109869 A 1.一种用于同时检测广东蜱夸兰菲尔病毒三个基因 的引物对， 所述引物对包括一条上 游引物和一条下游引物， 其特征在于， 所述上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 所 述下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示。 2.一种检测试剂盒， 其包括权利要求1所述的用于同时检测广东蜱夸兰菲尔病毒三个 基因的引物对。 3.一种同时检测广东蜱夸兰菲尔病毒三个基因的巢式PCR检测方法， 所述方法包括以 下步骤： 1)提取携带广东蜱夸兰菲尔病毒的蜱的样品RNA； 2)设计并合成PCR引物对， 所述引物对包括一条上游引物和一条下游引物， 所述上游引 物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 所述下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示； 3)以样品RNA为模板， 进行巢式PCR扩增； 4)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。 4.根据权利 要求3所述的方法， 其特征在于， 步骤3)中的巢式PCR扩增包括第一轮PCR反 应和第二轮PCR反应， 两轮PCR反应均使用步骤2)中的PCR引物对进行扩增。 5.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述第一轮PCR反应的反应体系为： RNase ‑ Free dH2O 3.4μL， 2 ×1 Step Buffer 5.0μL， 上游引物0.5μL， 下游引物0.5μL， PrimeScript  Enzyme 0.3 μL， 待检样品RNA  0.3 μL， 总共10 μL。 6.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述第一轮PCR反应的反应条件为： 50℃   30min； 94℃ 2min； 94℃ 30s， 50℃ 30s， 72℃ 1min 30s， 30个循环； 72℃  5min， 4℃保温。 7.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述第二轮PCR反应的反应体系为： RNase ‑ Free dH2O 3 μL， Premix  Taq 5 μL， 上游引物0.5 μL， 下游引物0.5 μL， 第一轮PCR反应产物1μ L， 总共10 μL。 8.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述第二轮PCR反应的反应条件为： 98℃   1min； 98℃ 30s， 50℃ 30s， 72℃ 1min 30s， 30个循环； 72℃  5min， 4℃保温。 9.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述上游引物和所述下游引物的浓度均为 10 μM。 10.根据权利要求3所述的方法， 其特 征在于， 所述样品RNA终浓度为20 0ng/ μL。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115109869 A 2用于检测广东蜱夸兰菲尔病毒 的引物对、 检测试剂盒及 巢式 PCR检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学领域， 具体涉及一种用于检测广东蜱夸兰菲尔病毒的引物 对、 包 括其的检测试剂盒以及巢式PCR检测方法。 背景技术 [0002]正粘病毒科(Orthomyxoviridae)包含7个病毒属， 分别为A型流感病毒、 B型流感病 毒、 C型流感病毒、 D型流感病毒、 托高土病毒属(Thogotovirus)、 夸兰菲尔病毒属 (Quaranfilvirus)  和传染性鲑鱼贫血病毒属(Isavirus)。 该科病毒感染宿主范围广， 包括 人、 鸟、 猪、 鱼和节  肢动物等。 传播途径也较多样， 包括粪便、 口腔、 水、 空气和直接接触等。 正粘病毒代表种  为A型禽流 感病毒， 禽流 感病毒主要通过口腔途径、 呼吸道途径、 气溶胶或 飞沫途径以及直  接接触感染人和禽类； B型流感病毒和C型流感病毒主要通过呼吸道传播 给人和哺乳动物；  传染性鲑鱼贫血病毒属目前只有一个种， 通过水源传播给鱼类； 托高土 病毒属主要通过蜱虫  感染哺乳动物； 夸兰菲尔病毒属是2011年新增的属， 目前病毒及参考 文献较少， 该属的病毒  主要是在禽类及蜱虫中发现的。 [0003]蜱传正粘病毒多为托高土病毒属和夸兰 菲尔病毒属病毒。 夸兰菲尔病毒属已知的 蜱媒病 毒有夸兰菲尔病毒(Quaranfilvirus， QRFV)和约翰斯登环状珊瑚岛病毒(John ston  Atoll virus， JAV)。 QRFV最初是从1953年埃及夸兰菲尔地区锐缘蜱属蜱类体内分离出来 的。 QRFV尚  无感染人的确切报道， 但有研究显示人群血清中有该病毒的特异性抗体存在 (J‑D Converse,  Moussa M‑I.Quaranfil  virus from Hyalomma  dromedarii(Acari: Ixodoidea)collected  in Kuwait, Iraq and Yemen[J].J  Med Entomol,1982,19(2): 209‑210.)。 JAV最早于1964年从中太平洋约  翰斯登环状珊瑚岛上的好望角钝缘蜱体内分 离出来， 该病毒目前亦无致人患病报道。 1966年  有文献报道， 在2名轻微发热最 终康复的幼 童血液中发现Q RFV， 虽然这些发现不能证明儿  童的疾病是由QRFV引起的， 但可能表明至少 有一种QRFV可以感染人类(F ‑J Austin.Johnston Atoll  virus(Quaranfil  group)from   Ornithodoros  capensis(Ixodoidea:Argasidae)infesting  a gannet colony  in New  Zealand[J].Am  J Trop Med Hyg,1978,27(5):1045 ‑1048.)。 这一事实也突显了监  测和诊 断蜱传新发病的重要性。 [0004]QRFV有6个节段， 分别编码聚合酶蛋白polymerase  basic 1protein(PB1)、 polymerase basic  2protein(PB2)、 pol ymerase acidic protein(PA)； 外层蛋白的血球凝 集素蛋白h emagglutinin p rotein(HA)、 膜蛋白matrix  protein(M)； 核蛋白nucleoprotein (NP)。 [0005]本研究前期通过宏转录组高通量测 序技术， 在广东省揭阳市的牛身上的微小牛蜱 中发现 了正粘病毒科、 夸兰菲尔病毒属的新种。 通过反转录 ‑巢式PCR及RACE末端序列扩增 方法， 获得该正粘病毒的全基因组(Genbank登录号为OM273643～OM273648)， 该病毒与最 相近 的正粘病毒氨基酸同源性仅为57％～89.3％， 根据本实验室对该病毒基因序列同源说　明　书 1/15 页 3 CN 115109869 A 3