(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210422002.4 (22)申请日 2022.04.21 (71)申请人 中国人民解 放军陆军 军医大学第一 附属医院 地址 400037 重庆市沙坪坝区高滩岩3 0号 (72)发明人 方杰　袁长婧　府伟灵　 (74)专利代理 机构 重庆航图知识产权代理事务 所(普通合伙) 50247 专利代理师 王贵君 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/70(2006.01) C12N 15/113(2010.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 基于Argonaute蛋白和指数扩增一步检测长 链RNA的试剂盒及检测方法及应用 (57)摘要 本发明公开了基于Argonaute蛋白和指数扩 增一步检测长链RNA的试剂盒及检测方法及应 用， 试剂盒包括TtAgo蛋白、 特异识别靶标长链 RNA的gDNA， 指数扩增模板、 DNA 聚合酶Bst  3.0、 切刻内切酶Nb.BtsI、 极高热稳定性单链结合蛋 白、 dNTP和荧光染料； 本发明的试剂盒结合了 TtAgo的高特异性切割和E XPAR的高效扩增优势， 用于单核苷酸突变的lncRNA  HOTAIR和KRAS ‑ G12D mRNA样品证实了 该方法具有识别单核苷酸 特异性。 新型冠状病毒RNA检测也证明了该方法 的通用性。 由于其优越的敏感性、 特异性、 简单 性、 快速性和恒温性， 有望成为定量检测RNA的有 力工具。 权利要求书1页 说明书10页 序列表6页 附图5页 CN 114606322 A 2022.06.10 CN 114606322 A 1.基于Argonaute蛋白和指数扩增一步检测长链RNA的试剂盒， 其特征在于： 所述试剂 盒包括TtAgo蛋白、 特异识别靶标长链RNA的gDNA， 指数扩增模板、 DNA聚合酶B st 3.0、 切刻 内切酶Nb.BtsI、 极高热 稳定性单链结合蛋白、 dNTP和荧 光染料； 所述指数扩增模板 由中心的切刻内切酶Nb.BtsI识别位点连接 的两端互补于trigger 序列的重复序列构成， 所述trigger序列为靶标长链RNA被TtAgo蛋 白切割后的3 ’端序列至 少10个序列； 所述gDNA的长度≥16nt。 2.根据权利要求1所述基于Argonaute蛋白和指数扩增一步检测长链RNA的试剂盒， 其 特征在于： 所述gDNA的5 ’端和3’端进行磷酸化修饰； 所述指数扩增模板的3 ’端进行 C3spacer修饰。 3.根据权利要求1所述基于Argonaute蛋白和指数扩增一步检测长链RNA的试剂盒， 其 特征在于： 所述靶标长链RNA为LncRNA  HOTAIR， 所述LncRNA  HOTAIR的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1 所示， 所述gDNA的核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示， 所述指数扩增模板的核苷酸序列如SEQ   ID NO.6所示， 扩增产物 trigger序列的核苷酸序列如SEQ  ID NO.8所示； 或， 所述靶标RNA为KRAS  mRNA G12D， 所述指数扩增模板的核苷酸序列如SEQ  ID NO.9 所示， 所述gDNA的核苷酸序列如SEQ  ID NO.10所示； 或， 所述靶标RNA为新型冠状病毒SARS ‑CoV‑2， 所述指数扩增模板的核苷酸序列如SEQ   ID NO.11所示， 所述gDNA的核苷酸序列如SEQ  ID NO.12所示。 4.利用权利要求1～3任一项所述试剂盒检测长链RNA的方法， 所述方法用于非诊断目 的， 其特征在于： 将TtAgo蛋白、 特异识别靶 标长链RNA的gDNA， 指数扩增模板、 DNA聚合酶Bst   3.0、 切刻内切酶Nb.BtsI、 极高热稳定性单链结合蛋白、 dNTP和荧光染料加入含有待测长链 RNA的反应 体系中， 在6 5℃～68℃之间， 充分反应， 根据荧 光信号计算靶标长链RNA的含量； 反应中核酸gDNA识别并与靶标RNA互补杂交， 引导TtAgo蛋白在靶标RNA序列上发生特 异性切割并产生含trigger序列的片段， 继而在指数扩增模板、 DNA聚合酶和内切酶存在下 引发指数扩增反应； 所述指数扩增模板由中心的切刻内切酶Nb.BtsI识别位点以及两端互 补于trigger序列的重复序列构成， 与trigger序列杂交， 并在DNA聚合酶Bst  3.0作用下延 伸形成双链DNA， 切刻内切酶Nb.BtsI识别并切割该双链DNA后， 再经DNA聚合酶Bst  3.0置换 作用产生新的trigger序列， 经过不断地延伸、 切割、 置换循环， 产生大量可检测产物， 并通 过荧光染料指示信号输出， 从而实现对目标物的一 步快速定量检测。 5.根据权利 要求4所述试剂盒检测长链RNA的方法， 其特征在于： 所述反应体系中TtAgo 与gDNA的摩尔比为1∶1； 每10微升反应体系中， B st 3.0DNA聚合酶量为0.2U， NbBtsI切刻内 切酶的量 为5U。 6.根据权利要求4所述试剂盒检测长链RNA 的方法， 其特征在于： 所述反应的时间控制 在100分钟以内。 7.权利要求1～3任一项所述试剂盒在制备检测长链RNA含量或长链RNA突变的试剂中 的应用。 8.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于： 检测长链RNA突变时所述单核苷酸突变位 点位于gDNA第五至 十三位核苷酸之间。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114606322 A 2基于Argonaute蛋白和指数扩增一步检测长链RNA的试剂盒及 检测方法及应用 技术领域 [0001]本发明涉及用于核酸检测和定量技术领域， 具体涉及基于Argonaute蛋白和指数 扩增一步检测长链RNA的试剂盒及检测方法及应用。 背景技术 [0002]肿瘤相关的长链RNA如长链非编码RNA(lncRNAs)和信使RNA(mRNA)的灵敏和特异 检测可能为癌症早期诊断、 治疗及预后带来新的机遇。 目前， 逆转录聚合酶链式反应 (reverse  transcriptase  polymerase  chain reaction， RT  PCR)仍然是各领域 中使用最 广泛的RNA定量检测方法， 但由于高能耗特点， 其在资源有限场地区和现场快速检验中的应 用受到极大限制。 近年来， 一些设计巧妙的恒温扩增方法已用于RNA检测， 如指数扩增反应 (exponential  amplification  reaction， EXPAR)、 滚环扩增和纳米探针。 然而， 由于长链 RNA无法充当引物， 导致这些方法不适合长链RNA的检测， 并且通常对单碱基变异的区分能 力较低。 因此， 仍然迫切需要建立具有阿摩尔灵敏度、 单碱基识别特异 性和反应方案简单的 恒温RNA检测方法。 [0003]近年来， 通过DNA干扰参与宿主防御的原核生物Argonaute蛋白(prokaryotic   Argonaute  proteins， pAgos)引起了研究人员的广泛关注。 各种pAgos具有结构相似性， 包 括N(N末端)结构域、 PAZ 结构域、 MID结构域和PIWI结构域。 这些特征赋予pAgos利用5 ′ ‑磷酸 化引导核酸靶向切割互补底物的特殊功能。 与Cas9和其他CRISPR相关的引导核酸酶类似， 这种新的酶切割活性可赋予pAgos执行相关特殊功能， 例如作为可编程的限制性内切核酸 酶和基因组编辑工具。 最近， 从嗜热栖热菌(Thermus  thermophilus， TtAgo)和激烈热球菌 (Pyrococcus  furiosus， PfAgo)中提取的pAgos的功能已得到开发， 基于pAgo的核 酸诊断前 景广阔。 例如， 一种称为NAVIGATER(通过嗜热栖热菌DNA引导的Argonaute进行核酸富集)的 基于TtAgo技术可以以单核苷酸的精度特异性切割引导核酸互补的DNA和RNA， 从而提高下 游检测方法如PCR和测序的灵敏度。 然而， 迄今为止报道的所有基于pAgo的方法要么将pAgo 介导的切割与后续步骤分开， 要么需要 热循环仪器以实现扩增。 因此， 仍然有必要建立一步 恒温扩增体系， 以进一 步探索pAgos在诊断领域的潜力。 [0004]在研究较明确的pAgos中， TtAgo(最适活性温度≥65℃)可能比PfAgo(最适活性温 度≥87℃)更适合建立恒温扩增体系， 因为大多数恒温扩增方法都是在较温和的恒定温度 下进行的。 TtAgo利用长度为16 ‑21nt的短5 ′ ‑磷酸化DNA作为引导核 酸(guide DNA， gDNA)与 底物靶向杂交， 而不受类似CRISPR相关系统中前间区序列邻近基序(protospacer   adjacent  motif， PAM)的限制。 然而， 它要求底物以单链形式存在以便结合和随后在引导核 酸的第10碱基和11碱基位置之间切割。 换句话说， TtA go可能更适合单链核酸的切割。 作为 一种多周转 酶， 单个TtAgo引导核酸结合复合物可以在 超过65℃的温度下切割多个底物， 这 表明它们非常有利于核酸的灵敏检测 。 与单链DNA识别 特异性相比， 切割位点近端RNA错配 的低耐受性也表 明TtAgo可以为RNA的检测提供