(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210417746.7 (22)申请日 2022.04.20 (71)申请人 广东海洋大学 地址 524088 广东省湛江市麻章区海大路1 号 申请人 中国科学院南海 海洋研究所 (72)发明人 李广丽　陈廷　王学峰　蒋谋炎　 田昌绪　孙彩云　朱春华　陈小丽　 刁德华　任春华　 (74)专利代理 机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 专利代理师 李珊珊 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12Q 1/6858(2018.01) G16B 10/00(2019.01) G16B 20/20(2019.01) G16B 40/00(2019.01) (54)发明名称 一种鉴定广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种的 SSR分子标记引物组及其应用 (57)摘要 本发明提供一种鉴定广西涠洲岛豹纹鳃棘 鲈原生种的SSR分子标记引物组及其应用。 本发 明通过研究得到一组能鉴定广西涠洲岛豹纹鳃 棘鲈原生种的SSR分子标记： PLWZ ‑01、 PLWZ‑02、 PLWZ‑03、 PLWZ‑04、 PLWZ‑05、 PLWZ‑06， 其核苷酸 序列分别如SEQ  ID NO.1～6所示， 该SSR分子标 记具有多态 性高， 但在广西涠洲岛原生群体中多 态性低的特点； 通过筛选得到用于扩增SSR分子 标记的引物组， 其扩增稳定、 重复性好； 同时建立 了鉴定广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种的方法， 解 决现有豹纹鳃 棘鲈地理种群鉴别不清晰， 在增殖 放流种种苗的原生种亲本难于判别的问题。 权利要求书2页 说明书7页 序列表4页 附图1页 CN 114891894 A 2022.08.12 CN 114891894 A 1.一种鉴定广西涠洲 岛豹纹鳃棘鲈原生种的SSR分子标记， 其特征在于， 所述SSR分子 标记为PLWZ ‑01、 PLWZ‑02、 PLWZ‑03、 PLWZ‑04、 PLWZ‑05、 PLWZ‑06， 其核苷酸序列分别如SEQ   ID NO.1～6所示。 2.一种扩增权利要求1所述S SR分子标记的引物组， 其特 征在于， 所述引物组为： 扩增PLWZ‑01的引物序列分别如SEQ  ID NO.7～8所示； 扩增PLWZ‑02的引物序列分别如SEQ  ID NO.9～10所示； 扩增PLWZ‑03的引物序列分别如SEQ  ID NO.11～12所示； 扩增PLWZ‑04的引物序列分别如SEQ  ID NO.13～14所示； 扩增PLWZ‑05的引物序列分别如SEQ  ID NO.15～16所示； 扩增PLWZ‑06的引物序列分别如SEQ  ID NO.17～18所示。 3.权利要求1所述SSR分子标记或权利要求2所述引物组在鉴定广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈 原生种或制备鉴定广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种的检测试剂盒中的应用。 4.一种鉴定广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种的检测试剂 盒， 其特征在于， 含权利要求1所 述SSR分子标记或权利要求2所述引物组。 5.一种鉴定广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1.收集待鉴定豹纹鳃棘鲈群 体样本， 提取样本DNA； S2.以步骤S1提取的DNA为模板， 分别 利用权利要求2中所述引物组进行PCR扩增； S3.对步骤S2扩增后的PCR产物进行毛细管电泳分型； S4.对步骤S3获得的分型 结果进行峰图判读和构建等 位基因矩阵； S5.通过步骤S4得到的待检测豹纹鳃棘鲈等位基因， 与已知广西涠洲 岛豹纹鳃棘鲈原 生种的等 位基因进行比较， 计算样品之间的遗传距离； S6.对步骤S5得到的遗传距离， 进行聚类分析， 构建聚类树， 并通过聚类树判断待检测 豹纹鳃棘鲈是否为涠洲岛原生种。 6.根据权利要求5所述方法， 其特征在于， 步骤S2中PCR扩增的反应体系为： 不含Mg2+的 10×PCR buffer 2.5 μL、 25mM  MgCl2 2.0 μL、 10mM  dNTP 0.5 μL、 高保真PCR酶1U、 10 μM正向 引物0.5 μL、 10 μM反向引物0.5 μL、 DNA模板12.5ng， 其 余由无菌双蒸水补足至25 μL。 7.根据权利 要求5所述方法， 其特征在于， 步骤S2中PCR扩增的反应程序 为： 95℃预变性 5分钟； 95℃变性3 0秒， 60℃退火3 0秒， 72℃延伸3 0秒， 共35个循环； 72℃再延伸6分钟。 8.根据权利要求5所述方法， 其特征在于， 步骤S3中毛细管电泳分型将步骤S2中采用的 引物组中的5 ’端标记FAM荧光基团， 并利用ABI  3730XL基因型分型测序仪进行毛细管电泳 分型。 9.根据权利要求5所述方法， 其特征在于， 步骤S5 中已知广西涠洲岛豹纹鳃棘鲈原生种 的等位基因为： PLWZ‑01位点为： 258、 261、 267； PLWZ‑02位点为： 195、 279、 282、 28 8； PLWZ‑03位点为： 238、 251、 25 6、 279； PLWZ‑04位点为： 237、 252、 25 5、 258； PLWZ‑05位点为： 257、 272、 2 91； PLWZ‑06位点为： 178、 19 9、 215、 219。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114891894 A 210.权利要求5～9任一所述方法在豹纹鳃棘鲈地理种群或鉴别增殖放流种种苗的原生 种亲本中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114891894 A 3