(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210419023.0 (22)申请日 2022.04.20 (71)申请人 青岛国际旅行卫 生保健中心(青岛 海关口岸门诊部） 地址 266000 山东省青岛市 市南区福州南 路85号 (72)发明人 徐颖　王岩　侯伟　闫吉辉　张娟　 滕新栋　刘海江　梁洁　张瑾　 徐翮飞　 (74)专利代理 机构 北京东方昭阳知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11599 专利代理师 吕燕 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 志贺氏菌快速一体化检测试剂盒 (57)摘要 本发明提供志贺氏菌快速一体化检测试剂 盒， 包括： 对照体系、 阳性质控品、 阴性质控品、 前 处理体系、 检测体系、 检测试剂I、 检测试剂II、 检 测试剂III； 本发明在核酸提取过程和核酸扩增 过程对仪器要求低， 检测特异性强与其他腹泻病 原体无交叉反应， 灵敏度是PCR检测1000 ‑10000 倍， 结果判读简单， 肉眼直接判读， 食品监督、 快 速检测现场和基层实验室都可以满足条件并开 展检测， 适 合推广使用。 权利要求书2页 说明书13页 序列表3页 附图3页 CN 114561481 A 2022.05.31 CN 114561481 A 1.志贺氏菌快速一体化检测试剂盒， 其特征在于， 所述志贺氏菌快速一体化检测试剂 盒包括： 对照体系 、 阳性质控品、 阴性质控品、 前处 理体系、 检测体系； 所述对照体系为分别装有绿色、 黄绿色、 浅黄绿色、 橙红色、 绿色液体的密封PCR反应 管； 所述阳性质控品为标准志贺氏菌基因组DNA的溶液， 其浓度为10‑2ng/ μL‑100ng/ μL， 优 选1ng/ μL； 所述阴性质控品为 不含有核酸的无菌去离 子水； 所述前处 理体系包括无菌 EP管、 提取 试剂I、 提取 试剂II、 提取试剂III； 所述检测体系包括可密封PCR反应管、 检测试剂I、 检测试剂II、 检测试剂III、 RPA通用 反应试剂冻干制剂； 所述RPA通用反应试剂冻干制剂装在可密封PCR反应管中； 所述检测试 剂I、 检测试剂I I、 检测试剂I II各自独立密封包 装； 所述检测试剂I为含有志贺氏菌检测上游引物F2和志贺氏菌检测下游引物R2的RPA通 用反应检测试剂， 所述检测试剂I中含有志贺氏菌检测上游引物F2浓度为0.28 μM ‑0.85 μM； 所述志贺氏菌检测下游引物R2浓度为0.28 μM ‑0.85 μM； 所述检测试剂I I为含有280mM醋酸镁的溶 液； 所述检测试剂I II为SYBR Green I溶液， 其浓度为10 0×‑10000×之间。 2.根据权利要求1所述的志贺氏菌快速一体化检测试剂 盒， 其特征在于： 所述对照体系 获取方法为： 按照本发明方法检测基因组DNA浓度为10‑3ng/ μL、 10‑4ng/ μL、 10‑5ng/ μL的三个 样品以及阴性质控品、 阳性质控品， 检测完成后得到5个检测结果， 结果颜色依次分别为绿 色、 黄绿色、 浅黄 绿色、 橙红色、 绿色， 参照上述检测结果的颜色， 用橙色和绿色染料配制5份 颜色与之对应一致的染色液， 将5种染色液加入P CR反应管中密封， 在P CR反应管的盖子或外 侧依次标注为10‑3ng/ μL、 10‑4ng/ μL、 10‑5ng/ μL、 阴性、 阳性， 上述5个密封PCR反应管作为对 照体系； 所述对照体系的密封PCR反应管中的液体容 量为50 μL‑200 μL， 优选为20 0 μL； 所述本发明检测待测样品中的志贺氏菌的步骤为： (1)核酸提取； (2)配制本发明的待 测样品的检测结果： 33.5 μL检测试剂I加入到可密封PCR反应管， 吹打混匀； 加入12 μL待测核 酸， 吹打混匀； 2.5 μL检测试剂II加入到可密封PCR反应管， 吹打混匀； 将2 μL的检测试剂III 滴加可密封PCR反应管的盖子内侧上； (3)盖上可密封PCR反应管盖子， 将PCR反应管放置25 ℃‑45℃中反应15min ‑25min； (4)结果检测： 将PCR反应管上下颠倒， 充分混匀PCR反应管中 液体； PCR反应管在室温放置1min ‑5min； 每次检测反应均同步检测阳性质控品、 阴性质控品 各一份； (5)结果判读： 首先检测阳性质控品的检测结果， 比对对照体系中标注为 “阳性”的 管的颜色一致为绿色， 且检测阴性质控品的检测结果比对对照体系中标注为 “阴性”的管的 颜色一致为橙红色， 判断本次检测结果可信， 否则结果不可信， 需要重新检测； 检测待测样 品的检测结果比对对照体系， 颜色为橙红色且与标注为 “阴性”的管的颜色一致， 判断为阴 性； 检测待测样品的检测结果颜色为绿色且与对照体系中标注为 “阳性”的管的颜色相近， 判断为阳性， 同时判断待测样品中提取得到的待测核酸浓度 大于10‑3ng/ μL； 检测待测样品 的检测结果颜色为黄绿色， 且与对照 体系中标注为 “10‑4ng/ μL”的管的颜色相近， 判断为阳 性， 同时判断待测样品中提取得到的待测核酸浓度接近10‑4ng/ μL； 检测待测样品的检测结 果颜色为浅黄绿色， 且与对照 体系中标注为 “10‑5ng/ μL”的管的颜色相近判断为阳性， 同时 判断待测样品中提取 得到的待测核酸浓度接 近10‑5ng/ μL；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114561481 A 2所述步骤(1)核酸提取的具体操作为： 1)待测样品为液体时每份样品取100μL ‑500μL， 待测样品为胶状或膏状或半固体状或固体时， 每份待测样品取100mg ‑500mg， 充分剪碎； 2) 所述待测样品加入 前处理体系， 充分混匀； 3)前处理体系放置90℃ ‑100℃孵育5min ‑25min； 4)将前处 理体系120 00g离心， 1mi n‑5min， 保留上清液， 上清液即为 提取得到的待测核酸。 3.根据权利要求2所述的志贺氏菌快速一体化检测试剂 盒， 其特征在于： 本发明的核酸 提取步骤的1)中， 优选的， 所述待测样品量与前处理体系的用量相同； 更优选的， 所述前处 理体系中的提取试剂I、 提取试剂II、 提取试剂III体积合为200ul； 更优选的， 所述待测样品 为液体时每份样品取200 μL， 待测样品为胶状或膏状或半固体状或 固体时， 每份待测样品取 200mg。 4.根据权利要求2所述的志贺氏菌快速一体化检测试剂 盒， 其特征在于： 核酸提取步骤 3)中， 更优选的， 100℃孵育10min； 待测样品核酸提取步骤4)中， 更优选的， 12000g离心 3min。 5.根据权利要求2所述的志贺氏菌快速一体化检测试剂 盒， 其特征在于： 所述本发明检 测待测样品中的志贺氏菌的步骤(3)中更优选的温度为35℃； 其中， 优选的反应时间为 15min‑20min。 6.根据权利要求5所述的志贺氏菌快速一体化检测试剂 盒， 其特征在于： 更优选的反应 时间为15mi n。 7.根据权利要求1所述的志贺氏菌快速一体化检测试剂 盒， 其特征在于： 所述阳性质控 品获取方法： 按照通用细菌基因组DNA提取试剂盒操作提取标准志贺氏菌基因组DNA， 从细 菌样品中获得DNA， 溶于TE溶液或无菌去离子水中， 检测核酸浓度后， 用TE溶液或无菌去离 子水稀释标准志贺氏菌基因组DNA浓度为10‑2ng/ μL‑100ng/ μL， 更优 选的稀释标准志贺氏菌 基因组DNA浓度为1ng/ μL。 8.根据权利要求1所述的志贺氏菌快速一体化检测试剂 盒， 其特征在于： 所述前处理体 系中提取试剂I为0.5mol/L  NaOH； 所述前处理体系中提取试剂II为2％浓度的Chelex ‑100； 所述前处 理体系中提取 试剂III为0.05mol/L的TrisH Cl； 三者以1:1:1的体积比例配制。 9.根据权利要求1所述的志贺氏菌快速一体化检测试剂盒， 其特征在于所述志贺氏菌 检测上游引物F6序列为:5' ‑GTCTTTCGCTGTTGCTGCTGATGCCACTGA ‑3'(SEQ ID NO11)， 所述志 贺氏菌检测下游引物序列R6为:5' ‑CTGAAGTTTCTCTGCGAGCATGGTCTGGAAGG ‑3'(SEQ ID NO  12)。 10.根据权利要求2所述的志贺氏菌快速一体化检测试剂盒， 其特征在于： 所述待测样 品的检测体系优选为50 μL的体系， 体系为： 12 μL提取待测样品后得到的待测核酸、 33.5 μL检 测试剂I、 2.5 μL检测试剂II、 2 μL的检测试剂III； 共50 μL， 所述检测试剂I为含有0.7μM的志 贺氏菌检测上游引物F2和0.7 μM的志贺氏菌检测下游引物R2的RPA通用反应检测试剂， 检测 试剂III为含有10 00×的SYBR Green I溶液。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114561481 A 3