(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210411190.0 (22)申请日 2022.04.19 (71)申请人 仲恺农业工程学院 地址 510225 广东省广州市海珠区纺织路 东沙街24 号 (72)发明人 江飚　苏友禄　孙龑鑫　刘春　 李薇　 (74)专利代理 机构 广州海心联合专利代理事务 所(普通合伙) 44295 专利代理师 马赟斋 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/365(2006.01) (54)发明名称 用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的引物、 荧光探 针和试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌 核酸的引物和荧光探针， 所述引物包括正向引物 和反向引物， 所述正向引物如序列表中SEQ  ID  NO.1； 所述 反向引物如序列表中SEQ  ID NO.2； 所 述荧光探针如序列表中SEQ  ID NO.3。 本发明还 公开了所述的用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的引 物和荧光探针的用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的 试剂盒。 本发 明通过在鰤鱼诺卡氏菌基因组中具 有多拷贝的ITS上选择一段保守序列， 并针对该 序列设计引物和探针， 使 得该引物和荧光探针具 有高特异性及高灵敏度， 不仅可以检测无发病症 状鱼类体内是否存在鰤鱼诺卡氏菌， 也可检测养 殖水体鰤鱼诺卡氏菌 丰度。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图2页 CN 115094151 A 2022.09.23 CN 115094151 A 1.一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的引物和荧光探针， 其特征是， 所述引物包括正向 引物和反向引物， 所述正向引物如序列表中SEQ  ID NO.1； 所述反向引物如序列表中SEQ  ID  NO.2； 所述 荧光探针如序列表中SEQ  ID NO.3。 2.根据权利要求1所述的用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的引物和荧光探针， 其特征是， 所 述荧光探针的5 ’端和3’端分别用荧 光报告基团和淬灭基团修饰。 3.根据权利要求2所述的用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的引物和荧光探针， 其特征是， 修 饰所述5’端的所述荧光报告基团为： FAM、 HEX、 ROX、 Cy3或Cy5， 修饰所述3 ’端淬灭基团为： TAMRA NHS、 BHO1、 BHO2、 BHO3或E clipse。 4.包含权利要求1 ‑3任一项所述的用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的引物和荧光探针的用 于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的试剂盒。 5.根据权利要求4所述的用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的试剂 盒， 其特征是， 所述正向引 物的终浓度为0.1～0.3 μM， 所述反向引物的终浓度为0.1～0.3 μM， 所述荧光探针的终浓度 为0.3～0.6 μM 。 6.根据权利要求4或5所述的用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的试剂 盒， 其特征是， 还包括： PCR反应液、 核酸释放试剂、 阴性质控品和阳性质控品。 7.根据权利要求6所述的用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的试剂盒， 其特征是， 所述PCR反 应液包括： 无菌水、 具有5 ’ →3’外切活性的DNA聚合酶、 dNTP、 10 ×PCR Buffer和含Mg离子的 溶液。 8.根据权利要求6所述的用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的试剂盒， 其特征是， 所述PCR反 应液中所述Taq酶的终浓度为0.01～0.03U/ μL， 所述dNTPs的终浓度为0.2～0.4mM， 所述10 ×PCR Buffer为原浓度的1/10， 所述MgCl2的终浓度为1.5～3.0mM， 溶剂为无菌水。 9.根据权利要求6所述的用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的试剂 盒， 其特征是， 所述核酸释 放试剂包括： 无菌水、 Triton ‑X100、 NP‑40和Tris ‑HCL； 所述阴性质控品为不含鰤鱼诺卡氏 菌的ITS基因的PMT18 ‑T载体质粒DNA； 所述阳性质控品为含有 所述鰤鱼诺卡氏菌的ITS基因 片段的PMT18 ‑T载体质粒DNA， 浓度为50ng/ μL； 所述具有5' →3'外切活性的DNA聚合酶为Taq 酶。 10.根据权利要求6所述的用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的试剂盒， 其特征是， 所述核酸 释放试剂中所述Triton ‑X100的终浓度为0.03～0.3％， 所述NP ‑40的终浓度为0.04～ 0.4％， 所述Tris ‑HCL的终浓度为0.01～0.1M， 溶剂为无菌 水； 所述Tri s‑HCL的pH值为7.8～ 8.2。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115094151 A 2用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸 的引物、 荧光探针和试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术领域， 具体涉及一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的引 物组、 荧光探针和试剂盒。 背景技术 [0002]鰤鱼诺卡氏菌在分类上属于细菌域、 厚壁菌门、 放线菌纲、 放线菌目、 诺卡氏菌科、 诺卡氏菌属。 鰤鱼诺卡氏菌是水产动物的主要致病菌， 宿 主广泛， 可感染多种淡水和海水鱼 类， 该菌所致的疾病日益严重， 对水产养殖产业造成巨大的经济损失， 同时也是水产品质量 安全隐患产生的重要因素之一。 诺卡氏菌病具有潜伏期时间长、 早期症状不明显等特点,然 而， 出现病症 时， 其内脏组织已出现大量 肉芽肿和坏死组织， 错失最佳治疗时间。 明确养殖 环境中病原菌丰度和早期诊断， 进 行提前预防是防治 该病的关键。 因此， 早期快速检测技术 就显得尤为重要和迫切。 现有技术中对鰤鱼诺卡氏菌的快速检测方法有聚合酶链式反应 (Polymerase  Chain Reaction,PCR)技术、 实时荧光定量PCR技术和环介导等温扩增技术 (loop‑mediated  isothermal  amplification,LAMP)。 [0003]在研究过程中， 发明人发现 现有技术至少存在以下问题： [0004]目前的实时荧光定量PCR技术只有染料法， 虽然该检测技术针对病鱼组织具有特 异性， 但诺卡氏菌属的细菌广泛存在自然环 境中， 使得基于染料法实时荧光定量P CR在检测 环境中的鰤鱼诺卡氏菌的特异性低， 此外， 报道的荧光定量PCR技术引物靶标基因为单拷 贝， 灵敏度不足检微量的鰤鱼诺卡氏菌。 而PCR技术灵敏度不足， 而高灵敏度的LAMP检测技 术易出现假阳性且不可定量， 难以应用于早期发病的鱼和养殖环境中病原的检测。 发明内容 [0005]为了解决现有技术中检测方法不能检出早期发病的鱼和环境中病原菌的问题， 本 发明提供一种用于检测早期发病鱼和环境中的鰤鱼诺卡氏菌核酸的引物、 荧光探针和试剂 盒。 [0006]本发明提供了一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的引物和荧光探针， 所述引物包括 正向引物和反向引物。 所述正向引物如序列表中SEQ  ID NO.1； 所述反向引物如序列表中 SEQ ID NO.2； 所述 荧光探针如序列表中SEQ  ID NO.3。 [0007]所述荧光探针的5 ’端和3’端分别用荧光报告基团和淬灭基团修饰， 修饰所述5 ’端 的所述荧光报告基团为： FAM、 HEX、 ROX、 Cy3或Cy5， 修饰所述3 ’端淬灭基团为： TAMRA  NHS、 BHO1、 BHO2、 BHO3或E clipse。 [0008]另一方面， 本发明提供一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的试剂盒， 所述试剂盒包 括上述的引物和荧 光探针。 [0009]进一步地， 所述试剂盒还包括： PC R反应液、 核酸释放试剂、 阴性质控品和阳性质控 品。 [0010]所述PCR反应液包括： 无菌水、 具有5 ’ →3’外切活性的DNA聚合酶、 dNTP、 10 ×PCR 说　明　书 1/6 页 3 CN 115094151 A 3