(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210408797.3 (22)申请日 2022.04.19 (71)申请人 中国人民解 放军军事科学院军事医 学研究院 地址 100850 北京市海淀区太平路27号院 (72)发明人 赵勇　杜奕溥　宋亚军　谭亚芳　 闫子恒　 (74)专利代理 机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 专利代理师 关畅 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12R 1/01(2006.01)C12R 1/07(2006.01) (54)发明名称 一种基于液滴数字PCR快速检测五种烈性病 原菌的引物探 针组合及其应用方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于液滴数字PCR快速检 测五种烈性病原菌的引物探针组合及其应用方 法。 所述引物探针组合包括五对引物对和相应的 六条探针； 其中一种病原菌采用两条不同荧光标 记的探针检测， 另外四种病原菌分别用一条单色 荧光标记的探针检测， 即可在数字PCR二维散点 图上分析五种不同靶标烈性细菌基因的扩增情 况。 实验证明， 所述引物探针组合能够特异性地 扩增与检测鼠疫菌、 炭疽菌、 布鲁氏菌、 类鼻疽菌 和土拉菌五种烈性病原体， 实现五靶标联检， 而 各引物对之间不会发生交叉反应， 而且对于每种 靶标都具有较高的检测灵敏度； 同时， 五靶标联 检能够有效减少样本用量、 缩短检测时间， 从而 有效提升烈性病原体的检测效率。 权利要求书2页 说明书10页 序列表3页 附图2页 CN 114891902 A 2022.08.12 CN 114891902 A 1.基于液滴数字PCR检测或辅助检测病原菌的组合物， 所述组合物由多重PCR引物对和 探针组合物组成； 所述多重PCR引物对和探针组合物由五对引物对和六条探针组成， 所述六条探针的每 个探针的核苷酸序列的5 ’端核苷酸上标记 荧光基团， 所述探针序列的3 ’端核苷酸上标记淬 灭基团； 所述病原菌为鼠疫耶尔森氏菌、 炭疽芽孢杆菌、 布鲁氏菌、 类鼻疽伯克霍尔德菌和土拉 弗朗西斯菌； 所述五对引物对分别能特异结合于所述五种病原菌的基因组， 所述五对引物 对中的一对引物对能特异结合于所述 五种病原菌中的一种病原菌的基因组； 所述六条探针 的两条探针能特异结合于所述 五种病原菌中的一种病原菌， 所述两条探针的名称为探针A ‑ T1和探针A ‑T2； 所述六条探针的其余四条探针 分别能特异结合于所述 五种病原菌其余四种 病原菌的基因组， 所述其余四条探针中的一条探针能特异结合于所述其余四种病原菌中一 种病原菌的基因 组； 所述探针A ‑T1和探针A ‑T2的5’端核苷酸上 标记有不同的荧 光基团。 2.根据权利要求1所述的组合物， 其特征在于： 所述探针A ‑T1和探针A ‑T2的摩尔比为1 ～1.5： 1.5～1。 3.根据权利要求1或2所述的组合物， 其特征在于： 所述五对引物对为引物对A、 引物对 B、 引物对C、 引物对D和引物对E； 所述六条探针为所述探针A ‑T1和A‑T2、 探针B ‑T、 探针C‑T、 探针D‑T和探针E ‑T； 所述引物对A和所述探针A ‑T1和A‑T2用于检测炭疽芽孢杆菌； 所述引物 对B和所述探针B ‑T用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌； 所述引物对C和所述探针C ‑T用于检测鼠 疫耶尔森氏菌； 所述引物对D和所述探针D ‑T用于检测布鲁氏菌； 所述引物对E和所述探针E ‑ T用于检测土拉弗朗西斯菌； 所述引物对A为由序列表中序列1所示的单链DNA和序列2所示的单链DNA组成的引物 对； 所述引物对B为由序列表中序列3所示的单链DNA和序列4所示的单链DNA组成的引物对； 所述引物对C为由序列表中序列5所示的单链DNA和序列6所示的单链DNA组成的引物对； 所 述引物对D为由序列表中序列7所示的单链DNA和序列8所示的单链DNA组成的引物对； 所述 引物对E为由序列表中序列9所示的单链DNA和序列10所示的单链DNA组成的引物对； 所述探针A ‑T1的核苷酸序列 为序列表中序列11； 所述探针A ‑T2的核苷酸序列 为序列表 中序列12； 所述探针B ‑T的核苷酸序列为序列表 中序列13； 所述探针C ‑T的核苷酸序列为序 列表中序列14； 所述探针D ‑T的核苷酸序列为序列表 中序列15； 所述探针E ‑T的核苷酸序列 为序列表中序列16 。 4.鉴定或辅助鉴定病原菌的试剂和/或试剂盒， 其特征在于： 所述试剂和/或试剂盒含 有权利要求1 ‑3中任一权利要求所述的组合物； 所述病原菌为鼠疫耶尔森氏菌、 炭疽芽孢杆菌、 布鲁氏菌、 类鼻疽伯克霍尔德菌和/或 土拉弗朗西斯菌 。 5.鉴定或辅助鉴定病原菌的系统， 其特征在于： 所述系统含有权利要求4所述的试剂 和/或试剂盒。 6.根据权利要求5所述的系统， 其特 征在于： 所述系统还 含有数字PCR系统。 7.检测或辅助检测病原菌的方法， 其特征在于： 所述方法包括用权利要求1 ‑3中任一项 所述的组合物， 或权利要求4所述的试剂或试剂盒或权利要求5或6所述的系统对待测样品 进行液滴数字PCR， 根据液滴数字PCR产物确 定或辅助确定待测样品是否为所述病原菌或，权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114891902 A 2是否含有 所述病原菌或， 是否感染所述病原菌， 所述病原菌为鼠疫耶尔森氏菌、 炭疽芽孢杆 菌、 布鲁氏菌、 类鼻疽伯克霍尔德菌和/或土拉弗朗西斯菌 。 8.根据权利 要求7所述的方法， 其特征在于： 所述液滴数字PCR中采用的PCR体系中所述 引物对A、 引物对B、 引物对C、 引物对D和引物对E的摩尔比为1:1:1:1:1， 所述探针A ‑T1、 探针 A‑T2、 探针B ‑T、 探针C‑T、 探针D‑T和探针E ‑T的摩尔比为1～1.5:1.5～1:1:2:2:3 。 9.权利要求1 ‑3中任一权利要求所述的组合物在制备检测或辅助检测鼠疫耶尔森氏 菌、 炭疽芽孢杆菌、 布鲁氏菌、 类鼻疽伯克霍尔德菌和/或土拉弗朗西斯菌产品中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114891902 A 3