(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210405282.8 (22)申请日 2022.04.18 (71)申请人 宁波检验检疫科 学技术研究院(宁 波国检贸易便利化 服务中心) 地址 315000 浙江省宁波市海曙区马园路9 号 (72)发明人 段维军　李雪莲　吕燕　张慧丽　 (74)专利代理 机构 宁波诚源专利事务所有限公 司 33102 专利代理师 陈洪娜　陈蕾 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一种大豆北方茎溃疡病菌检测用引物探针 及试剂盒和检测方法 (57)摘要 本发明涉及一种大豆北方茎溃疡病检测用 引物探针及试剂盒和检测方法， 本发 明中的检测 方法具有操作简单、 快速以及准确率高的优点， 为实现对大豆北方茎溃疡病菌在感病植株上的 快速鉴定检测打下理论基础， 并且， 该检测方法 不仅能检测具有较多鉴定特征的大豆北方茎溃 疡病菌成熟菌丝体， 还可以对形态特征与大豆北 方病茎溃病菌相似的近似种进行有效区分。 其 中， 本发明中的引物和探针特异性强， 而本分明 中的试剂盒具有快速简单、 特异性强、 灵敏度高 以及交叉污染低的优点。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图6页 CN 114574625 A 2022.06.03 CN 114574625 A 1.一种大豆北 方茎溃疡病检测用引物， 其特 征在于， 正向引物DCF的核苷酸序列为： 5' ‑CGGCCA AGCTAACTCTTGTTTT‑3'， 反向引物DCR的核苷酸序列为： 5' ‑AGATCCGTTGTTGAA AGTTTTGATT‑3'。 2.一种大豆北 方茎溃疡病检测用探针， 其特 征在于， 所述探针DCP的核苷酸序列为： 5' ‑CACTGA AACTCTGAGA AAT‑3'。 3.如权利要求2所述的大豆北方茎溃疡病检测用探针， 其特征在于， 所述探针DCP的5' 端含有FAM报告荧 光染料， 而3'端含有不发荧 光的淬灭基团并具有MGB分子 。 4.一种大豆北方茎溃疡病检测用试剂 盒， 其特征在于， 具有如权利要求1所述的大豆北 方茎溃疡病检测用引物。 5.如权利要求4所述的大豆北方茎溃疡病检测用试剂 盒， 其特征在于， 还具有如权利要 求2或3所述的大豆北 方茎溃疡病检测用探针。 6.如权利要求5所述的大豆北方茎溃疡病检测用试剂盒， 其特征在于， 还包括2x Universal PCR Master Mix反应缓冲液。 7.如权利要求5所述的大豆北方茎溃疡病检测用试剂盒， 其特征在于， 所述正向引物 DCF、 反向引物DCR以及探针DCP的终浓度均为10 μmo l/L。 8.一种大豆北 方茎溃疡病的检测方法， 其特 征在于包括以下步骤： (1)待测样品DNA提取； (2)利用如权利要求1所述的引物及权利要求2或3所述的探针进行实时荧 光PCR反应； (3)结果判定： 观察反应扩增曲线及其Ct值， 若有特异性扩增， Ct值超过阈值即为大豆 北方茎溃疡病菌 。 9.如权利要求8所述的大豆北方茎溃疡病的检测方法， 其特征在于， 应用有如权利要求 6或7所述的大豆北 方茎溃疡病检测用试剂盒。 10.如权利要求9所述的大豆北方茎溃疡病的检测方法， 其特征在于， PCR反应体系： 反 应缓冲液5 μL， 正向引物DCF和反 向引物DCR各0.5 μL， 探针DCP0.6 μL， 加入1μL模板DNA溶液， 用灭菌双蒸水定容至10 μL， 进行实时荧 光PCR反应； 实时荧光PCR反应条件为： 50℃  30min； 95℃  15min； 然后94℃  15s， 60℃  60s， 共40个 循环。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114574625 A 2一种大豆北方茎溃疡病菌检测用引物探针及 试剂盒和检测 方法 技术领域 [0001]本发明涉及 生物技术领域， 尤其涉及一种大豆北方茎溃疡病菌检测用 引物探针及 试剂盒和检测方法。 背景技术 [0002]大豆北方茎溃疡病菌(Diaporthe  phaseolorum  var.caulivora)， 其无性型为 Phomopsis  phaseoli， 属于真菌界Fungi、 子囊菌门Ascomycota、 子囊菌亚门 Pezizomycotina， 粪壳菌纲Sordariomycetes， 间座壳目Diaporthales、 间座壳科 Diaporthac eae， 间座壳属Diaporthe。 大豆北方茎溃疡病菌主侵染植株的茎杆和叶片， 导致 植株死亡， 造成大豆产量降低， 是比较典型的大豆上毁灭性病害之一。 大豆北方茎溃疡病菌 于20世纪40年代后 期至50年代 早期在美国中北部和加拿大被发现， 1950年病原菌被鉴定为 Diaporthe phaserlorum  var.batatati s， Crall将其命名为大豆茎溃疡病菌 大豆北方茎溃 疡病菌， 现主要分布于北美洲的美国、 加拿大， 南美洲的阿根廷、 巴西、 厄瓜多尔， 大洋洲的 澳大利亚， 欧洲的保加利亚、 克罗地 亚、 南斯拉夫、 法国、 意大利、 俄罗斯、 塞尔维亚 等。 [0003]20世纪50年代， 该病菌在美国中北部地区造成了主要的作物损失， 多达80％的植 物感染， 单田产量减少了50％。 鉴于其严重危害性， 该病菌于2007年被列入我国进境植物检 疫性有害生物名录。 对于大豆北方茎溃疡病菌检测， 目前主要以形态学加普通PCR方法鉴 别， 该种检测方法存在鉴定周期长、 时效性差等问题。 而标准SN/T  3399‑2012 《大豆茎溃疡 病菌检疫鉴定方法TaqMan  MGB探针实时荧光PCR检测方法》 中的实时荧光检测方法， 对 大豆 北方茎溃疡的近似种也产生了特异性扩增， 出现假阳性 等问题。 发明内容 [0004]本发明所要解决的第一个技术问题是针对现有技术而提供一种特异性强的大豆 北方茎溃疡病菌检测用引物。 [0005]本发明所要解决的第二个技术问题是针对现有技术而提供一种特异性强的大豆 北方茎溃疡病菌检测用探针。 [0006]本发明所要解决的第三个技术问题是针对现有技术而提供一种灵敏性高、 检测准 确率高的大豆北 方茎溃疡病菌检测用试剂盒。 [0007]本发明所要解决的第四个技术问题是针对现有技术而提供一种检测准确率高的 大豆北方茎溃疡病菌的检测方法。 [0008]本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为： 一种大豆北方茎溃疡病检 测用引物， 其特 征在于， [0009]正向引物DCF的核苷 酸序列为： 5' ‑CGGCCA AGCTAACTCTTGTTTT ‑3'(如SEQ  ID NO.2 所示)， [0010]反向引物DCR的核苷酸序列为： 5' ‑AGATCCGTTGTTGAA  AGTTTTGATT ‑3'(如SEQ  ID 说　明　书 1/5 页 3 CN 114574625 A 3