(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210401046.9 (22)申请日 2022.04.18 (71)申请人 中国农业科 学院北京畜牧兽医研究 所 地址 100193 北京市海淀区 圆明园西路2号 (72)发明人 狄冉　储明星　王翔宇　贺小云　 刘玉芳　范业锴　 (74)专利代理 机构 北京高沃 律师事务所 1 1569 专利代理师 张梦泽 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12Q 1/6888(2018.01) (54)发明名称 一种miRNA及其特异性检测方法和应用 (57)摘要 本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种 miRNA及其特异性检测方法和应用。 以本发明提 供的miRNA核苷酸序列为基础， 利用本发明提供 的特异性引物和检测方法， 可以对 oar‑miR‑3965 的转录水平进行快速、 精确的定量。 采用本发明 提供的miRNA可以将处于繁殖季节和非繁殖季节 (休情期)中的绵羊进行有效区分， 为后续研究和 生产提供检测方法。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图1页 CN 114657182 A 2022.06.24 CN 114657182 A 1.一种miRNA， 其特 征在于， 所述miRNA的成熟序列的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示。 2.一种扩增权利要求1所述的miRNA的特异性引物组， 其特征在于， 所述特异性引物组 包括反转录茎环引物、 上游引物和下游引物， 所述反转录茎环引物的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.5所示， 所述上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示， 所述下游引物的核苷 酸序列如 SEQ ID NO.4所示。 3.权利要求1所述miRNA的检测方法， 其特征在于， 利用权利 要求2所述的特异性引物组 测定样品中所述miRNA的有无和/或表达量。 4.根据权利要求3所述的检测方法， 其特 征在于， 所述测定的方法包括 荧光定量PCR。 5.根据权利要求4所述的检测方法， 其特征在于， 所述荧光定量PCR的反应体系以20μL 计， 包括模板cDNA2.0 μL， SYBR  TaqTM 10 μL， 上游引物0.8 μL， 下游引物0.8 μL， ROX 染料Ⅱ0.4 μL和水6 μL； 所述模板 cDNA包括将从待测样品中提取 得到的RNA进行反转录后得到的cDNA。 6.根据权利要求4或5所述的检测方法， 其特征在于， 所述荧光定量PCR的程序为： 95℃ 预变性30s； 95℃变性5s， 6 0℃退火34s， 40个 循环。 7.根据权利要求4或5所述的检测方法， 其特征在于， 利用所述荧光定量PCR进行检测 时， 还包括内参基因， 所述内参基因为U6  snRNA。 8.根据权利要求5所述的检测方法， 其特 征在于， 所述待测样品包括绵羊下丘脑。 9.权利要求1所述的miRNA、 权利 要求2所述的miRNA特异性引物组或权利要求3～8任一 项所述的检测方法在动物分子 遗传学中的应用。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特 征在于， 所述应用包括 鉴定绵羊所处的繁殖时期。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114657182 A 2一种miRNA及其特异性检测方 法和应用 技术领域 [0001]本发明属于生物技 术领域， 具体涉及一种miRNA及其特异性检测方法和应用。 背景技术 [0002]miRNA(microRNA)是一组由基因组编 码的长度约20～23个核苷酸的非编 码RNA， 类 似于siRNA的分子， 通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或阻碍其 翻译。 miRNAs在物种进化中相当保守， 在植物、 动物和真菌中发现的miRNAs只在特定的组织 和发育阶段表达， miRNA组织特异性和时序性决定了组织和细胞的功能特异性， 表 明miRNA 在细胞生长和发育过程的调节过程中起多种作用。 [0003]绵羊的繁殖季节是经过长期的自然选择逐渐演化而形成的， 其主要决定因素是分 娩时的环境条件要有利于初生羔羊的存活， 同时， 绵羊的繁殖季节因品种、 地区、 光照、 气 温、 饲草饲料等条件而有差异。 本领域多通过外部观察或试情等常规方式区分绵羊的繁殖 时期， 但存在一定误差。 对于需要进 行绵羊季节 性繁殖研究的母羊， 要求对样本母羊的繁殖 时期进行准确区分和鉴定， 因此miRNA为绵羊繁殖时期的鉴定提供了 工具。 发明内容 [0004]本发明的目的在 于提供一种miRNA及其特异性检测方法和应用， 可以对miRNA的转 录水平进行快速、 精确的定量， 从而有效判断绵羊所处的繁殖时期(繁殖季节或非繁殖季 节)。 [0005]本发明提供了一种miRNA， 所述miRNA的成熟序列的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所 示。 [0006]本发明还提供了一种扩增 上述技术方案所述的miRNA的特异性引物组， 所述特异 性引物组包括反转录茎环引物、 上游引物和下游引物， 所述茎环引物的核苷酸序列如SEQ   ID NO.5所示， 所述上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示， 所述下游引物的核苷酸序 列如SEQ ID NO.4所示。 [0007]本发明还提供了上述技术方案所述的miRNA的检测方法， 利用所述的特异性引物 组测定样品中所述miRNA的有无和/或表达量。 [0008]优选的， 所述测定的方法包括 荧光定量PCR。 [0009]优选的， 所述荧光定量P CR的反应体系以20 μL计， 包括模板cDNA2.0 μL， S YBR TaqTM  10 μL， 上游引物0.8 μL， 下游引物0.8 μL， ROX染料 Ⅱ0.4 μL和水6 μL； [0010]所述模板 cDNA包括将从待测样品中提取 得到的RNA进行反转录后得到的cDNA。 [0011]优选的， 所述荧光定量PCR的程序为： 95℃预变性30s； 95℃变性5s， 60℃退火34s， 40个循环。 [0012]优选的， 利用所述荧光定量PCR进行检测时， 还包括内参基因， 所述内参基因为U6   snRNA。 [0013]优选的， 所述待测样品包括绵羊下丘脑。说　明　书 1/5 页 3 CN 114657182 A 3