(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210404867.8 (22)申请日 2022.04.18 (71)申请人 扬州大学 地址 225009 江苏省扬州市大 学南路88号 (72)发明人 左示敏　杜海波　高鹏　冯志明　 胡珂鸣　陈宗祥　谢文亚　王广达　 (74)专利代理 机构 南京纵横知识产权代理有限 公司 32224 专利代理师 董建林 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 鉴别基因编辑抗纹枯病水稻材料ckx7-1的 特异性dCAP S分子标记及应用 (57)摘要 本发明公开了鉴别基因编辑抗纹枯病水稻 材料ckx7 ‑1的特异性dCAPS分子标记及应用， 属 于生物技术领域。 根据基因编辑材料ckx7 ‑1中 CKX7发生变异的位点 设计了特异性的dCAPS分子 标记dC‑CKX7， 用相应的限制性内切酶SpeI酶切 PCR产物， 最后根据片段能否被Spe  I酶切开判断 水稻株系中是否含有 突变基因ckx7 ‑1。 本发明的 dCAPS标记可实现ckx7 ‑1基因型的高效鉴定， 检 测结果准确可靠， 在利用基因编辑系ckx7 ‑1进行 分子标记辅助选择抗纹枯病育种中具有重要应 用价值。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图3页 CN 114908184 A 2022.08.16 CN 114908184 A 1.鉴别基因编辑抗纹枯病水稻材料ckx7 ‑1的特异性dCAPS分子标记， 其特征在于， 所述 分子标记的序列如SEQ  ID NO.3所示。 2.用于检测权利要求1所述分子标记的特异性引物， 其特征在于， 所述特异性引物正向 引物序列如SEQ  ID NO.1所示， 反向引物序列如SEQ  ID NO.2所示。 3.含有权利要求2所述特异性引物的试剂盒。 4.权利要求3所述的试剂盒， 其特 征在于， 试剂盒还 含有限制性内切酶Spe  I。 5.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的特异性引物或权利要求3所述的试剂 盒在水稻抗纹枯病育种中的应用。 6.一种抗纹枯病水稻鉴定方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 提取供试水稻样品基因 组DNA； 利用权利要求2所述的分子标记对上述DNA进行PCR扩增； 将扩增产物经 过限制性内切酶Spe  I酶切， 并对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。 7.根据权利要求6所述的抗纹枯病水稻鉴定方法， 其特征在于， 如果所述扩增产物能够 切成26bp和126b p的特征条带， 所述样品为ckx 7‑1基因纯合基因编辑系； 如果所述扩增产物 不能被酶切， 只含有151bp的特 征条带， 所述样品为野生型。 8.根据权利要求6所述的抗纹枯病水稻鉴定方法， 其特征在于， 扩增条件为95℃5min； 95℃30s， 58℃3 0s， 72℃3 0s， 32个循环； 72℃延伸10mi n， 结束反应。 9.根据权利 要求6所述的抗纹枯病水稻鉴定方法， 其特征在于， 酶切体系为PCR产物8.8 μL， 10*M Buffer 1 μL， Spe I 0.2 μL， 37℃水浴2h 。 10.根据权利要求6所述的抗纹枯病水稻鉴定方法， 其特征在于， PCR扩增的扩增体系为 DNA模板1μL， 10 ×PCR buffer 2 μL， dNTP  0.4 μL， 上游引物0.4 μL， 下游引物0.4 μL， Taq  DNA 聚合酶0.4 μL， d dH20 15.4 μL。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114908184 A 2鉴别基因编辑抗纹枯病水稻材料ckx7 ‑1的特异性dCAPS分子 标记及应用 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种能够用于鉴别水稻抗纹枯病基 因编辑材 料ckx7‑1的特异性dCAP S标记方法及应用。 背景技术 [0002]水稻(Oryza  sativa L.)是我国最重要的粮食作物之一， 有一半以上人 口以稻米 为主食。 由立枯丝核菌(Rhizoctonia  solani)引起的纹枯病是水稻最重要的病害之一。 水 稻纹枯病从苗期至穗期均可发生， 发病的部位主要在水稻的叶鞘和叶片， 严重时可向上扩 展直至穗部， 其流行时可引起10 ‑25％的产量损失， 严重时可以造成甚至50％的减产。 抗性 遗传研究结果表明， 水稻对纹枯病的抗性受多基因控制， 为典型数量性状， 易受环境影响。 目前， 被定位的抗纹枯病QT L(quantitative  trait locus)数目有100个以上， 但这些QT L的 抗性效应均较小， 迄今只有少数几个QTLs实现了精细定位， 未见克隆的报道， 抗病机理不 明， 严重影响了水稻抗纹枯病育种进程。 前期研 究表明， 提高水稻细胞分裂素(cytokinin， CK)含量有利于增强水稻对纹枯病的抗性， 敲除CK代谢相关基因能够增强水稻对纹枯病的 抗性。 CK脱氢酶基因(cytokinin  oxidase/dehy drogenases， CKXs)是CK降解途径中的关键 基因， 其中， 将CKX7基因敲除后能显著 提高水稻对纹枯病的抗性， 同时敲除系与野生型在 主 要农艺性状上没有差异， 因此CKX7基因在水稻抗纹枯病基因编辑育种中具有重要价值和意 义。 [0003]酶切扩增多态性序列(Cleaved  Amplified  Polymorphic  Sequences， CAPS)或 dCAPS(derived  CAPS)标记在设计引物时， 一对PCR引物中的一条引物上引入错配碱基， 利 于该错配碱基与单核苷酸变异处的特定碱基重新组建为一个限制性内切酶的识别序列， 扩 增产物再用特定限制性内切酶进行切割， 即可产生片段大小差异， 进而可通过凝胶电泳进 行分离检测， 在检测过程中需要增加一步酶切消化环节， 但耗时并不长(1 ‑2小时)， 结果却 十分准确、 不存在假阳性， 且可一次性区分杂合基因型与纯合基因型， 具有较好的实际应用 价值。 [0004]我们前期通过CRISPR/Cas9技术对水稻CKX7基因进行了基因编辑， 获得了一个纹 枯病抗性显著提高的CKX7基因功能缺失纯合敲除系ckx 7‑1。 为提高ckx 7‑1敲除系在抗纹枯 病育种中的利用效率， 我们开发了一种用于区分ckx 7‑1敲除系与野生型的dCAPS分子标记， 以实现ckx7 ‑1基因型的高效鉴定， 在后续利用ckx7 ‑1进行抗纹枯病育种中具有重要价 值。 发明内容 [0005]本发明提出一种用于鉴别水稻抗纹枯病基因编辑材料ckx7 ‑1的特异性dCAPS标记 方法及应用， 以实现ckx7 ‑1基因型的高效鉴定 。 [0006]本发明为 解决上述 技术问题提出的技 术方案是： [0007]鉴别基因编辑抗 纹枯病水稻材料ckx7 ‑1的特异性dCAPS分子标记， 其特征在 于， 所说　明　书 1/4 页 3 CN 114908184 A 3