(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210400599.2 (22)申请日 2022.04.16 (71)申请人 宁波大学 地址 315211 浙江省宁波市江北区风 华路 818号 (72)发明人 郭俊明　宋雪梅　俞秀冲　翁秋燕　 张双双　谢瑶瑶　 (74)专利代理 机构 宁波诚源专利事务所有限公 司 33102 专利代理师 徐雪波　叶桂萍 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 检测血浆中tRF水平的胃癌分子标记物以及 应用 (57)摘要 本发明涉及一种检测血浆中tRF水平的胃癌 分子标记物以及应用， 其特征在于： 包括用于检 测血浆样本中tRF ‑20‑V29K9UV3和tRF ‑27‑ 87R8WP9N1E5 的其中一个或是二个联合的试剂， 与现有技术相比， 本发明的优点在于： 本发明的 试剂盒将tRF ‑20‑V29K9UV3和tRF ‑27‑ 87R8WP9N1E5 单独或是联合作为早期胃癌辅助诊 断的标志物， 可根据检测目的选择相应的检测靶 标进行绝对定量检测， 仅需少量样品即可快速、 准确地完成靶 标分子的绝对定量检测， 及胃早癌 的筛查与鉴别， 灵敏度高， 准确率高， 检测快速 。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图7页 CN 114875145 A 2022.08.09 CN 114875145 A 1.一种用于胃癌辅助诊断的检测试剂盒， 其特征在于： 包括用于检测血浆样本中tRF ‑ 20‑V29K9UV3、 tRF ‑27‑87R8WP9N1E 5的其中一个或是二个联合的试剂， 其中： tRF‑20‑V29K9UV3的核苷酸序列如SEQ  ID No.1所示， 所述tRF ‑20‑V29K9UV3在胃早癌 患者血浆中显著上调； 所述引物为： F1： 5' ‑CCGTTGGTAGGATGGGGTGT ‑3'； R1： 5' ‑ GGTACCTCCTCTCTTCTCTACT ‑3'； tRF‑27‑87R8WP9N1E 5的核苷酸序列如SEQ  ID No.2所示， 所述tRF ‑27‑87R 8W P9N1 E5 在胃 早 癌患者血浆中 显著上 调 ； F 2 ： 5 ' ‑ GGTCTCTGGTGGTCTAGTG GT‑3'； R2： 5' ‑GGTACCTCCTCTCTTCTCTACT ‑3'。 2.根据权利要求1所述的用于胃癌辅助诊断的检测试剂 盒， 其特征在于： 所述试剂 盒还 包括有tRF ‑20‑V29K9UV3和tRF ‑27‑87R8WP9N1E 5的逆转录引物序列， 其中， tRF‑20‑V29K9UV3的逆转录序列如SEQ  ID No.3所示： 5' ‑GCAGACGAGGGTACCTCCTCTCTT CTCTACTCGTGTC CTACCCTCGTCTGCAC CTAT‑3'； tRF‑27‑87R8WP9N1E5的逆转录序列如SEQ  ID No.4所示： 5' ‑GCAGACGAGGGTACCTCCTCT CTTCTCTACTCGTGTC CTACCCTCGTCTGCGA ATCC‑3'。 3.根据权利要求1或2所述的用于胃癌辅助诊断的检测试剂盒， 其特征在于： 所述试剂 盒还包括有tRF ‑20‑V29K9UV3和tRF ‑27‑87R8WP9N1E 5的探针引物序列， 其中， tRF‑20‑V29K9UV3的 探针 引物序列如SEQ  ID No .5所示 ： 5 ' ‑FAM‑ TGTCCTACCCTCGTCTGCAC CTAT‑TAMRA‑3'； tRF‑27‑87R8WP9N1E5的探针引物序列如SEQ  ID No .6所示： 5 ' ‑FAM‑ AGGATTCGCAGACGAG GGTAGGACA‑TAMRA‑3'。 4.一种检测血浆中tRF分子标记物的方法， 其特征在于： 所述tRF分子标记物为权利要 求1中所述的tRF ‑20‑V29K9UV3和tRF ‑27‑87R8WP9N1E 5， 所述的方法包括如下步骤： (1)采集血 液， 提取血浆中的总RNA； (2)将总RNA逆转录成cDNA； (3)利用tRF ‑20‑V29K9UV3和tRF ‑27‑87R8WP9N1E5的特异性扩增引物对步骤(2)的cDNA 溶液进行荧 光定量PCR检测， 反应结束后检测荧 光信号值并设定 Y值； (4)获得每个样品的Cq值， 也就是y值， 并按所检测t RF对应的标准曲线计算出相应的拷 贝数x后， 将按照400 ×10x/3计算每个样品对应1mL血浆时的拷贝数， 并进行早期胃癌患者 1mL血浆内tRF ‑20‑V29K9UV3和tRF ‑27‑87R8WP9N1E 5拷贝数的统计学分析。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114875145 A 2检测血浆中tRF水 平的胃癌分子标记物以及应用 技术领域 [0001]本发明涉及一种血浆中转运RNA衍生片段的检测方法， 尤其涉及一种血浆中tRF胃 癌分子标记 物的检测及其应用。 背景技术 [0002]根据世界卫生组织2021年报告的流行病学统计数据， 2020年世界范围内胃癌的新 发病例超过100万例， 因胃癌死亡病例 超过76万， 胃癌是全球排名第五位的恶性肿瘤。 在我 国， 根据2020年发布的流行病学调查显示， 2015年胃癌相关性死亡是仅次于肺癌、 肝癌的癌 症相关性死 亡原因。 [0003]早诊断早治疗对于改善胃癌的高死亡率具有重大意义。 目前对于胃癌诊断的金标 准是内窥镜取组织进行病理检查， 但由于其有创性在一定程度上限制 了它的推广， 而传统 的肿瘤标志物如癌胚抗原(carcinoembryonic  antigen,CEA)、 糖类抗原12 5(carbohydrate   antigen 125,CA125)和糖类抗原19 ‑9(carbohydrate  antigen 19‑9,CA19‑9)等敏感性和 特异性均不高。 因此， 开 发新型胃癌相关标志物对于提高胃癌的早期诊断效率， 具有重要的 临床意义。 [0004]近年来， 随着高通量测 序技术的发展， 人们逐渐发现一类新型非编码RNA ——tRNA 衍生片段(t RNA derived fragment， tRF)， 是由t RNA前体(pre ‑tRNA)或成熟t RNA在特异性 核糖核酸酶(如Dicer酶或血管生成素等)作用下裂解而成。 tRF具有多种 生物学功能， 如参 与逆转录调控、 逆转录后调控、 翻译调控和表观遗传调控等。 另外， 它们还参与多种癌症的 发生发展。 因此， 它 们作为胃癌诊断标志 物具有较大潜力。 发明内容 [0005]本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种用于胃癌辅助 诊断的检测试剂盒。 [0006]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为： 该用于胃癌辅助诊断的检测试剂 盒， 其特征在于： 包括用于检测血浆样本 中tRF‑20‑V29K9UV3、 tRF ‑27‑87R8WP9N1E5的其中 一个或是二个联合的试剂， 其中： [0007]tRF‑20‑V29K9UV3的核苷酸序列如SEQ  ID No.1所示， UAGGAUGGGGUGUGAUAGGU， 所 述tRF‑20‑V29K9UV3在胃早癌患者血浆中显著上调； 所述引物为 ： F1 ： 5 ' ‑ CCGTTGGTAGGATGGGGTGT‑3'； R1： 5'‑GGTACCTCCTCTCTTCTCTACT ‑3'； [0008]t R F‑2 7‑8 7 R 8 W P 9 N 1 E 5 的 核 苷 酸 序 列 如 S E Q  I D N o .2 所 示 ， UCCCUGGUGGUCUAGUGGUUAGGAUUC， 所述tRF ‑27‑87R8WP9N1E5在胃早癌患者血浆中显著上调； F2： 5'‑GGTCTCTGGTGGTCTAGTG GT‑3'； R2： 5' ‑GGTACCTCCTCTCTTCTCTACT ‑3'。 [0009]进一步地， 所述试剂盒还包括有tRF ‑20‑V29K9UV3和tRF ‑27‑87R8WP9N1E5的逆转 录引物序列， 其中， [0010]tRF‑20‑V29K9UV3的逆转录序列如SEQ  ID No.3所示： 5' ‑GCAGACGAGGGTACCTCCTC说　明　书 1/6 页 3 CN 114875145 A 3