(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210414359.8 (22)申请日 2022.04.15 (71)申请人 浙江美之奥种业股份有限公司 地址 314000 浙江省嘉兴 市秀洲区洪合 镇 泾桥村 （洪建公路泾桥村北段东侧） (72)发明人 武婷　巫水钦　马存发　赵辉　 赵立坚　肖建成　余永辉　 (74)专利代理 机构 北京超凡宏宇专利代理事务 所(特殊普通 合伙) 11463 专利代理师 覃蛟 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) A01H 1/04(2006.01) (54)发明名称 一种鉴定自交不亲和系 Ⅱ类S单元型青花菜 的引物对及其应用和鉴定方法 (57)摘要 本发明公开了一种鉴定自交不亲和系 Ⅱ类S 单元型青花菜的引物对及其应用和鉴定方法， 属 于生物技术领域。 该引物对包括引物SP11 ‑2F和 引物SP11 ‑2R； 引物SP11 ‑2F的碱基序列如SEQ  ID  NO.1所示， 引物SP11 ‑2R的碱基序列如SEQ  ID  NO.2所示。 上述引物对可以特异性地扩增出SP11 基因的DNA片段， 通过一次扩增即可鉴定出待测 样本是否为自交不亲和系 Ⅱ类S单元型青花菜， 相应的鉴定方法不仅简单便捷， 还 具有准确性和 灵敏度高、 检测速度快、 稳定性高、 特异性强的特 点。 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图1页 CN 114561489 A 2022.05.31 CN 114561489 A 1.一种鉴定自交不亲和系 Ⅱ类S单元型青花菜的引物对， 其特征在于， 所述引物对包括 引物SP11‑2F和引物S P11‑2R； 所述引物SP11 ‑2F的碱基序列如SEQ  ID NO.1所示， 所述引物SP11 ‑2R的碱基序列如SEQ   ID NO.2所示。 2.一种鉴定自交不亲和系 Ⅱ类S单元型青花菜的产品， 其特征在于， 所述产品中包含有 权利要求1所述的引物对。 3.根据权利要求2所述的产品， 其特 征在于， 所述产品为试剂或试剂盒。 4.如权利要求1所述的引物对或权利要求2所述的产品在鉴定自交不亲和系 Ⅱ类S单元 型青花菜中的应用。 5.如权利要求1所述的引物对或权利要求2所述的产品在自交不亲和系 Ⅱ类S单元型青 花菜育种中的应用。 6.一种鉴定自交不亲和系 Ⅱ类S单元型青花菜的方法， 其特征在于， 所述方法包括对待 测样品的DNA模板进行P CR扩增， 并检测扩增产物中是否含有SP11基因的DNA片段， 若扩增产 物中含有S P11基因的DNA片段， 则待测样品为自交不亲和系 Ⅱ类S单元型青花菜； 所述PCR扩增时使用的引物包括权利要求1或2所述的引物对。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特 征在于， 所述S P11基因的DNA片段的长度为3 62bp。 8.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述PCR扩增的体系包括所述引物SP11 ‑ 2F， 所述引物S P11‑2R， 2×Utaq PCR Mix， 模板DNA， d dH2O； 优选地， 每20 μL所述PCR扩增体系中， 含有1uL  10 μM所述引物SP11 ‑2F， 1uL 10 μM所述引 物SP11‑2R， 10uL 2×Utaq PCR Mix， 1uL模板DNA， 7uL  ddH2O。 9.根据权利 要求6所述的方法， 其特征在于， 所述PCR扩增的条件包括在94 ‑98℃预变性 1‑5min； 94‑95℃变性20 ‑40s， 50‑55℃退火20 ‑30s， 70‑72℃延伸20 ‑40s， 25‑35个循环； 70 ‑ 72℃延伸0 ‑10min； 优选地， 所述PCR扩增的条件包括在94℃预变性4min； 94℃ 变性30s， 52℃退火30s， 72℃ 延伸30s， 30个循环； 72℃延伸7mi n。 10.根据权利要求6所述的方法， 其特 征在于， 采用凝胶电泳方法检测所述扩增产物； 优选地， 所述凝胶电泳是采用2 ‑3％的琼脂糖凝胶在100 ‑110V恒压下50 ‑60min进行电 泳检测。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114561489 A 2一种鉴定自交不亲和系 Ⅱ类S单元型青花菜的引物对及其应 用和鉴定方 法 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术领域， 具体而言， 涉及一种鉴定自交不亲和系 Ⅱ类S单元型青 花菜的引物对及其应用和鉴定方法。 背景技术 [0002]青花菜(Brassica  oleracea  L.var.italica)又名西兰花， 属十字花科芸薹属甘 蓝种， 原产于地中海东部沿岸地区， 具有很高的营养和保健价值。 十字花科植物具有自交不 亲和特性， 为显花植物在长期进化过程中， 防止近亲繁殖、 保证遗传多样性和物种延续的重 要遗传机制 。 青花菜属于典型 的孢子体 自交不亲和体系， 由一个具有复等位基因且高度多 态性的S位点控制。 每一个S位点包含多个S等位基因， 又称S单元型， 且存在编码雌、 雄S决定 因子的基因。 目前， 已知与S位点连琐的基因有3类， 分别为S位点受体激酶(S ‑locus  receptor  kinase)基因、 S位点糖蛋白(S ‑locus glycoprotein)基因、 S位点蛋白11(S ‑ locus protein 11)和S位点富半胱氨酸蛋白基因(S ‑locus cysteine ‑rich protein)基 因。 SCR/SP11基因在雄蕊花药中表达， 而SRK和SLG基因在雌蕊柱头中表达。 其自交不亲和现 象为花粉和柱头乳突细胞间的相互识别等发生一系列的生化反应， 使柱头具有识别自体花 粉和异体花粉的能力。 [0003]青花菜育种工作国内起步较晚， 自交不亲和系制种是杂种优势利用的重要途径 之 一， 因此前期的育种工作重点均集中在自交不亲和系的选育。 然而近年来市场供应的青花 菜商品种几乎为细胞质雄性不育(CMS)， 即表现为花粉败育、 雌蕊正常， 此特性可免去蕾期 人工去雄， 节省大量的人力物力， 并提高了杂交种子的纯度， 然而 无法留种进 行自交分离选 育育种工作， 导致种源 “卡脖子”问题。 青花菜品种CMS系的广泛应用， 使得育种选育工作方 向转变， 自交不亲和系的材料选育转变为自交亲和系 材料选育。 目前育种家拥有的高世代 亲本材料基本上为自交不亲和系， 特别是作为母本的亲本材料基本上表现为 强自交不亲和 性， 仍需要蕾期人工授粉、 种子产量低等问题， 因此自交亲和系材料的选育筛选工作急需跟 进。 [0004]根据S位点基因序列的相似性， 芸薹属自交不亲和等位基因分为两大类： Ⅰ类和Ⅱ 类。 其中Ⅰ类S单元型为强自交不亲和性， Ⅱ类S单元型为弱自交不亲和性。 已知文献报道区 分自交不亲和系 Ⅰ类S单元型的引物PK1/PK4， Ⅱ类S单元型的引物KD4/KD7， 均根据SRK基因 进行设计的， 并成功用于甘蓝、 白菜等芸苔属作 物的筛选工作， 然而 该两对引物的扩增片段 均在1kb左右， 大片段条带对制胶 浓度、 跑胶条件要求严格， 才能获得干净清晰不拖尾带型， 而且存在扩增条带不稳定的问题， 需要试验重复才能准确判断材料 的自交不亲和类型。 而 目前报道的青花菜作 物根据SP11基因设计地相关引物,实际用于材料鉴定上无法有效地区 分自交不亲和系 Ⅰ类和Ⅱ类S单元型。 因此本研究针对SP11基因开发出新的特异引物,用于 青花菜自交不亲和系 Ⅱ类S单元型的筛选， 也就是自交亲和系材 料的选育筛选。 [0005]鉴于此， 特提出本发明。说　明　书 1/7 页 3 CN 114561489 A 3