(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210400018.5 (22)申请日 2022.04.15 (71)申请人 北京市农林科 学院 地址 100097 北京市海淀区曙光 花园中路9 号 (72)发明人 毛爱军　温常龙　张建　杨静静　 张晓飞　夏昌选　赵泓　王航　 (74)专利代理 机构 北京五洲洋和知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11387 专利代理师 荣红颖　刘春成 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种鉴定黄瓜黑星病抗性的方法及SNP专用 引物组和应用 (57)摘要 本发明属于黄瓜品种选育技术领域， 提供一 种鉴定黄瓜黑星病抗性的方法及SNP专用引物组 和应用。 所述SNP位点为如下第五SNP位点和/或 第八SNP位点： 第五SNP位点M2710369位于2号染 色体的27 10369处， 该位点的核苷酸碱基为A或T； 第八SNP位点M27315 74位于2号染色体的27315 74 处， 该位点的核苷酸碱基为T或G。 第五SNP位点： A:A纯合型为抗黄瓜黑星病， T: T纯合型为易感或 感黄瓜黑星病； 第八SNP位点： T:T纯合型为抗黄 瓜黑星病， G:G纯合型为易感或感黄瓜黑星病。 利 用本发明的SNP位点开发的特异性扩增引物， 可 以高效、 准确地鉴定黄瓜品种的黑星病抗性， 提 高育种效率。 权利要求书2页 说明书12页 序列表6页 附图3页 CN 114908183 A 2022.08.16 CN 114908183 A 1.一种用于鉴定黄瓜黑星病抗性的SNP位点， 其特征在于， 所述SNP位点为如 下第五SNP 位点和/或第八SNP位点： 第五SNP位点M2710369， 所述第五SNP位点位于2号染色体的 2710369处， 该位点的核苷酸碱基为A或T； 第八SNP位点M2731574， 所述第八SNP位点位于2号 染色体的2731574处， 该位点的核苷酸碱基为T或G； 第五SNP位点对应的基因型： A:A纯合型 为抗黄瓜黑星病的基因型， T:T纯合型为易感或感黄瓜黑星病的基因型； 第八SNP位点对应 的基因型： T:T纯合型为抗黄瓜黑星病的基因型， G:G纯合型为易感或感黄瓜黑星病的基因 型。 2.一种用于鉴定黄瓜黑星病抗性的SNP引物 组， 其特征在于， 所述引物 组选自第五KASP 引物对和/或第 八KASP引物对， 所述第五KASP引物对用于扩增鉴定黄瓜黑星病 抗性的所述 第五SNP位点， 或确定所述第五SNP位点对应的基因型； 所述第 八KASP引物对用于扩增鉴定 黄瓜黑星病 抗性的所述第 八SNP位点， 或确 定所述第 八SNP位点对应的基因型； 每个KASP引 物对均包括： 第一 正向引物、 第二 正向引物和通用反向引物。 3.如权利要求2所述的用于鉴定黄瓜黑星病抗性的SNP引物组， 其特征在于， 所述第五 KASP引物对中： 第一正向引物的碱基序列如序列表SEQ  ID NO.1所示， 具体为： 5 ’ ‑ CATCAAACCTTGAAGAGTTGTATCTCT ‑3’； 第二正向引物的碱基序列如序列表SEQ  ID NO.2所示， 具体为： 5 ’ ‑CATCAAACCTTGAAGAGTTGTATCTCA ‑3’； 通用反向引物的碱基序列如序列表SEQ  ID  NO.3所示， 具体为： 5 ’ ‑GAGAAAACAGACTTATCTATCATTCCTAAATTTG ‑3’； 所述第八KASP引物对 中 ： 第一 正向 引物的 碱基 序 列如 序 列表 SEQ  I D NO .4所 示 ， 具 体为 ： 5 ’‑ GAGCAGTTAGGCAATCTGGTGAAT ‑3’； 第二正向引物的碱基序列如序列表SEQ  ID NO.5所示， 具 体为： 5’ ‑AGCAGTTAGGCAATCTGGTGAAG ‑3’； 通用反向引物的碱基序列如序列表SEQ  ID NO.6 所示， 具体为： 5 ’ ‑CTCGATCCTCCTGAAGATACAAACAG‑3’。 4.如权利要求3所述的用于鉴定黄瓜黑星病抗性的SNP引物组， 其特征在于， 每个KASP 引物对中的所述第一正向引物和 第二正向引物的5 ’端分别连有不同的荧光接头序列； 优选 地， 所述荧光接头序列选择 FAM、 HEX、 FITC、 RED、 TET、 JOE、 R 110中的一种。 5.一种试剂盒， 包括如权利要求2 ‑4任一项所述的引物组和PCR反应试剂。 6.如权利要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 所述PCR反应试剂为具有竞争性等位基因 特异性PCR检测能力的试剂； 优选地， 所述PCR反应试剂为Master  mix。 7.如权利要求1所述的SNP位点、 或者权利要求2 ‑4任一项所述的SNP引物组、 或者权利 要求5或6所述的试剂盒在以下任一方面的应用： (a)辅助选育抗黑星病的黄瓜品种； (b)鉴 定黄瓜品种对黑星病的抗 性。 8.一种鉴定待测黄瓜黑星病抗性的方法， 包括如下步骤： (1)待测黄瓜样品基因组DNA 的提取； (2)以待测黄瓜样品基因组DNA为模板， 分别利用上述引物组中的各引物对进 行PCR 扩增； (3)对扩增产物进行荧光检测和分析， 获得待测黄瓜样品对应SNP位点的基因型， 由此 确定待测黄瓜样品对黑星病的抗性； 其中确定待测黄瓜样品是否具有黑星病抗性的条件选 自如下中的一种或多种： 当基于第五SNP位点M2710369的基因型为T:T纯合型时， 待测黄瓜 样品抗黑星病； 基于第五SNP位点M2710369的基因型为A:A纯合型时， 待测黄瓜样品为易感 或感黑星病 黄瓜品种； 或者/和， 当基于第八SNP位点M2731574的基因型为G:G纯合时， 待测 黄瓜样品抗黑星病； 基于第八SNP位点M2731574的基因型为T:T纯合型时， 待测黄瓜样品感 黑星病。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114908183 A 29.如权利要求8所述的鉴定黄瓜黑星病抗性的方法， 其特征在于， 所述PCR扩增的条件 依次为： 94℃预变性15分钟； 在94℃下变性20s； 61℃ ‑55℃下退火1min， 共10个循环， 61℃为 第一个循环的退火温度， 之后每个循环退火温度降低0.6℃； 94℃变性20s； 55℃复性/延伸 1min， 共26个 循环。 10.如权利要求9所述的鉴定黄瓜黑星病抗性的方法， 其特征在于， 所述引物组中， 各引 物对的第一正 向引物、 第二正 向引物和通用反向引物在PCR体系中的浓度比为2:2:5； 优选 地， 所述待测黄瓜样品基因 组DNA的浓度为10 ‑30ng/ μL。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114908183 A 3