(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210391403.8 (22)申请日 2022.04.14 (71)申请人 武汉大学中南医院 地址 430071 湖北省武汉市武昌区东湖路 169号 申请人 北京优乐复生科技有限责任公司 　 中国科学院昆明动物研究所 (72)发明人 王行环　肖宇　张翼　钱开宇　 彭旻晟　鞠林高　王刚　 (74)专利代理 机构 武汉科皓知识产权代理事务 所(特殊普通 合伙) 42222 专利代理师 江慧 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01)C12N 15/11(2006.01) G16B 20/30(2019.01) G16H 50/20(2018.01) (54)发明名称 膀胱癌检测的DNA甲基化多重PCR试剂盒及 其应用 (57)摘要 本发明公开了一种膀胱癌检测的DNA甲基化 多重PCR试剂盒及其应用， 所述试剂盒包括： 用于 膀胱癌检测的DNA甲基化标志物的引物对： 引物 对1‑7， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.1‑SEQ ID  NO.14所示。 主要用于膀 胱癌患者的辅助诊断， 在 患者手术前进行诊断与类型鉴别， 为患者后续的 治疗提供有效依据， 操作简单， 周期较短， 大大缩 短了对膀胱癌及其病理分型的诊断， 有助于更快 地为患者提供有效且针对性强的治疗 方案， 也有 助于患者的预后。 权利要求书3页 说明书12页 序列表3页 附图2页 CN 114774544 A 2022.07.22 CN 114774544 A 1.一种用于膀胱癌检测的DNA甲基化标志物 组合， 其特征在于， 所述用于膀胱癌检测的 DNA甲基化标志 物组合包括： DNA甲基化标志 物BSP_SOX_1， 位于 3号染色体上的181427281 ‑181427781位置； DNA甲基化标志 物BSP_SOX_2， 位于 3号染色体上的1814 46253‑181446753位置； DNA甲基化标志 物BSP_SOX_3， 位于 3号染色体上的18149 9969‑181500569位置； DNA甲基化标志 物BSP_SOX_4， 位于 3号染色体上的18143 0262‑18143120 0位置； DNA甲基化标志 物BSP_SOX_5， 位于 3号染色体上的18143810 0‑181438500位置； DNA甲基化标志 物BSP_SOX_6， 位于 3号染色体上的181428015 ‑181428515位置； DNA甲基化标志 物BSP_SOX_7， 位于 3号染色体上的18143 6974‑181437700位置。 2.一种用于膀胱癌检测的DNA甲基化标志物 的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括： 用于膀胱癌检测的DNA甲基化标志 物的引物对： 引物对1， 用于检测DNA甲基化标志物BSP_SOX_1， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.1‑SEQ ID  NO.2所示； 引物对2， 用于检测DNA甲基化标志物BSP_SOX_2， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.3‑SEQ ID  NO.4所示； 引物对3， 用于检测DNA甲基化标志物BSP_SOX_3， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.5‑SEQ ID  NO.6所示； 引物对4， 用于检测DNA甲基化标志物BSP_SOX_4， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.7‑SEQ ID  NO.8所示； 引物对5， 用于检测DNA甲基化标志物BSP_SOX_5， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.9‑SEQ ID  NO.10所示； 引物对6， 用于检测DNA甲基化标志物BSP_SOX_6， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.11‑SEQ  ID NO.12所示； 引物对7， 用于检测DNA甲基化标志物BSP_SOX_7， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.13‑SEQ  ID NO.14所示。 3.根据权利要求2所述的一种用于膀胱癌检测的DNA甲基化标志物的试剂盒， 其特征在 于， 所述试剂盒还包括： 阳性质控品、 阴性质控品、 PCR预混液、 文库接头引物和文库扩增酶， 其中所述PCR预混液包括： 10 ×Buffer、 10mMdNTPs、 25mMMgCl2、 AmpliTaq  Gold  DNAPolymerase和NF ‑H2O。 4.一种权利要求1所述的用于膀胱癌检测的DNA甲基化标志物、 权利要求2 ‑3所述的用 于膀胱癌检测的DNA甲基化标志 物的试剂盒在制备膀胱癌检测产品中的应用。 5.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于， 所述应用包括： 通过尿液辅助诊断是否患 有膀胱癌； 进一 步辅助鉴别膀胱癌分型： 浸润性膀胱癌和非浸润性膀胱癌； 具体包括： 提取受试者的尿液cfDNA进行亚硫酸盐处 理， 获得受试者样品； 采用权利要求2 ‑3所述的用于膀胱癌检测的DNA甲基化标志物的试剂盒对所述受试者 样品进行多重PCR， 后进行高通 量测序， 获得受试者的 甲基化谱； 将所述受试者的甲基化谱与构建的分类器中膀胱癌特异甲基化谱模型进行比较， 识别 其中膀胱癌特异性的DNA甲基化模式特征， 通过广义线性模型计算尿液中是否存在膀胱癌 特征性的甲基化信号评价分数， 用于判定是否为膀胱癌；权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114774544 A 2进一步将识别的膀胱癌特异性的DNA甲基化序列与构建的分型分类器 中浸润性膀胱癌 特异甲基化谱模 型进行比较， 提取其中浸润性膀胱癌特异 性的DNA甲基化模式特征， 通过广 义线性模型计算是否为浸润性膀胱癌特征性的甲基化信号评价分数， 用于判定为浸润性膀 胱癌或非浸润性膀胱癌； 通过以下判定方法进行判定： 若膀胱癌特 征性的甲基化信号评价分数为阳性， 则判定受试者 为膀胱癌； 若膀胱癌特征性的甲基化信号评价分数为阳性， 同时浸润性膀胱癌特征性的甲基化信 号评价分数为阳性， 则判定受试者 为浸润性膀胱癌； 若膀胱癌特征性的甲基化信号评价分数为阳性， 同时浸润性膀胱癌特征性的甲基化信 号评价分数为阴性， 则判定受试者 为非浸润性膀胱癌。 6.一种用于膀胱癌检测的系统， 其特 征在于， 所述系统包括： 采集模块， 用于计算阳性质控品甲基化谱、 阴性质控品甲基化谱和受试者的 甲基化谱； 比较模块， 用于将所述采集模块获得的甲基化谱与构建的分类器中膀胱癌特异甲基化 谱模型进行比较， 识别其中膀胱癌特异 性的DNA甲基化模式特征， 通过广义线性模 型计算尿 液中是否存在膀胱癌特征性的甲基化信号评价分数， 若膀胱癌特征性的甲基化信号评价分 数为阳性， 则判定受试者 为膀胱癌。 7.根据权利要求6所述的一种用于膀胱癌检测的系统， 其特 征在于， 所述系统还 包括： 区分亚型模块， 用于区分浸润性膀胱癌和非浸润性膀胱癌， 对所述比较模块识别的膀 胱癌特异 性的DNA甲基化序列与构建的分型分类器中浸润性膀胱癌特异甲基化谱模型进 行 比较， 提取其中浸润性膀胱癌特异 性的DNA甲基化模式特征， 通过广义线性模型计算是否为 浸润性膀胱癌特 征性的甲基化信号评价分数： 若膀胱癌特征性的甲基化信号评价分数为阳性， 同时浸润性膀胱癌特征性的甲基化信 号评价分数为阳性， 则判定受试者 为浸润性膀胱癌； 若膀胱癌特征性的甲基化信号评价分数为阳性， 同时浸润性膀胱癌特征性的甲基化信 号评价分数为阴性， 则判定受试者 为非浸润性膀胱癌。 8.一种用于膀胱癌检测的系统， 其特 征在于， 所述系统包括： 处理器和存储器， 所述存储器耦接到所述处理器， 所述存储器存储指令， 当所述指令由 所述处理器执行时使用以下步骤： 采集模块步骤： 将所述的高通量测序数据进行目标区域读段截取， 低质量读段过滤， 计 算每个序列甲基化水平， 统计在各水平时序列出现的频率， 形成甲基化谱， 并存储于存储器 中； 比较模块步骤： 将甲基化谱与分类器模型进行比较， 通过广义线性模型计算存在膀胱 癌特征性的甲基化信号评价分数， 输出分数， 并存 储于存储器中； 若上一步分数为阳性 时， 则进一步执行区分亚型模块步骤， 与分类器模型进行比较， 提 取浸润性膀胱癌特异性的DNA甲基化模式特征， 通过广义线性模型计算为浸润性膀胱癌特 征性的甲基化信号评价分数， 输出分数， 并存 储于存储器中。 9.一种计算机可读存储介质， 其上存储有计算机程序， 其特征在于， 所述计算机程序被 处理器执行权利要求8所述的步骤。 10.一种膀胱癌检测产品， 其特 征在于， 包括：权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 114774544 A 3