(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210387692.4 (22)申请日 2022.04.13 (71)申请人 江西农业大 学 地址 330000 江西省南昌市志敏大道1 101 号 (72)发明人 刘栋　曾明阳　李家增　霍云馨　 王泽泉　许翠康　 (74)专利代理 机构 南昌洪达专利事务所 3 6111 专利代理师 刘凌峰 (51)Int.Cl. C12N 15/29(2006.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种提高种子在黑暗和盐胁迫条件下萌发 率的拟南芥PIF1基因及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种提高种子在黑暗和盐胁 迫条件下萌 发率的拟南芥PIF1基因及其应用， 所 述拟南芥PIF1基因的序列如SEQ  ID NO:1所示。 通过PCR扩增的方法鉴定pif1为T ‑DNA插入的功 能缺失型突变体， 利用野生型拟南芥Col和pif1 为试验材料， 统计其在黑暗和盐胁 迫条件下种子 的萌发率， 并通过实时荧光定量PCR的方法检测 盐胁迫响应标记基因的表达水平， 进一步证实 pif1突变体种子在萌发阶段对盐胁迫的敏感性 显著降低。 权利要求书1页 说明书6页 序列表3页 附图2页 CN 114836432 A 2022.08.02 CN 114836432 A 1.一种提高种子在黑暗和盐胁迫条件下萌发率的拟南芥PIF1基因， 其特征在于： 所述 拟南芥PIF1基因的序列如SEQ  ID NO:1所示。 2.一种如权利要求1所述的拟南芥PIF1基因的应用， 其特征在于： 通过PCR扩增的方法 鉴定pif1为T ‑DNA插入的功能缺失型突变体， 利用野生型拟南芥Col和pif1为试验材料， 统 计其在黑暗和盐胁迫条件下种子的萌发率， 并通过实时荧光定量PCR的方法检测盐胁迫响 应标记基因的表达水平， 进一步证实pif1突变体种子在萌发阶段对盐胁 迫的敏感性显著降 低。 3.根据权利要求2所述的一种拟南芥PIF1基因的应用， 其特征在于： T ‑DNA插入功能缺 失型突变 体的鉴定方法， 具体操作步骤如下， (1)提取野生型拟南芥 Col和pif1突变 体萌发48小时种子的DNA； (2)以DNA为模板， 在 pif1突变 体T‑DNA插入位点的两侧设计PIF1的特异性引物序列； 其中所设计的PCR扩增引物序列如下： 上游引物： 5 ’ ‑GACAGTTCCGCCGTAGCTG G‑3’ 下游引物： 5 ’ ‑AGCAGCACGAGATCTCT TGG‑3’； (3)以提取的DNA为模板进行PCR扩增， 然后对产物进行琼脂糖凝胶电泳 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114836432 A 2一种提高种子在黑暗和盐胁迫条件下萌发率的 拟南芥PIF1基 因及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及 植物基因工程技术领域， 具体涉及一种提高种子在 黑暗和盐胁迫条件 下萌发率的拟南芥PIF1基因及其应用。 背景技术 [0002]逆境胁迫是影响植物正常生长发育和限制农作物产量的主要因素之一， 并在全球 范围内造成的农作物产量损失十分巨大， 可使平均产量下降65％～87％。 我国土地资源丰 富， 但盐碱土的比例很高。 据报道， 盐碱地在我国的面积大、 类型多， 并且盐碱地的面积在逐 步扩大。 严重影响农业的可持续 发展。 因而提高作物的耐盐性， 减少盐胁迫对农作 物生长的 抑制和产量的限制成为目前研究 的热点之一。 在盐胁 迫下， 植物关闭一些正常表达的基因， 但启动一些与盐胁迫相关特异基因的表达， 其表达模式的改变以利于抵御盐胁迫。 因此， 分 离和鉴定参与植物响应盐胁迫的关键基因， 并明确其在植物响应盐胁迫调控网络的生物学 功能， 不仅对于深入理解植物适应盐胁迫的分子机制具有重要的理论意义， 而且为提高农 作物的耐盐性 提供重要的基因资源。 [0003]植物遭受盐胁迫后， 首先引起渗透胁迫， 继而造成离子失衡， 致使营养元素的亏 缺， 最终引起氧化胁迫导致生物膜透性改变、 生理生化代谢紊乱以及有毒物质的积累。 在长 期进化及环境适应的过程中， 植物形成了一系列适应盐胁迫的生理和分子机制， 主要包括 调节离子转运、 区域化维持离子平衡、 提高激素水平、 增加渗透调节物质的积累、 提高抗氧 化酶的活性以及调控盐胁迫响应基因的表达来应对盐胁迫。 在植物响应盐胁迫的信号途径 中， SOS(Salt  Overly Sensitive)信号是研究的比较清楚的途径之一。 Zhu 等(1998)通过对 拟南芥多个sos突变体的筛选， 鉴定出SOS1、 SOS2和SOS3是SOS信 号途径中参与调节盐胁迫 下细胞Na+/K+平衡的重要组分。 SOS3是该信号途径中的上游组分， 当植物处于高浓度Na+胁 迫下， 细胞中的第二信使Ca2+浓度升高， SOS3感知Ca2+信号， 同时与SOS2蛋白C末端的FISL结 构域结合， 激活SOS2的蛋 白激酶活性， SOS3 ‑SOS2蛋白激酶复合体调控SOS1 的表达， SOS1发 挥功能将Na+排出， 维持细胞内Na+/K+的平衡， 因而植物能够忍耐盐胁 迫。 随着现代分子生物 学的发展， 有关对植物响应盐胁迫机制的研究也深入到基因组学、 转录组学、 蛋白质组学、 代谢组学和离子组学等水平。 利用 “组学”技术的研究能够更全面地揭示植物响应盐胁迫的 机理， 并为耐盐基因的鉴定和盐胁迫信号途径中重要组分的挖掘提供强有力的手段。 如对 盐胁迫后大麦、 棉花、 大豆、 苜蓿等植物转录组学进 行分析， 发现了许多编码氮吸收、 激素合 成与运输、 活性氧清除、 离子转运与交换、 生物膜稳定以及信号转导途径中的基因表达发生 了明显的变化， 通过对筛选出的重要基因利用正向或反向遗传学的方法对其功能进行鉴 定， 以明确这些差异表达的基因在响应盐胁迫中的功能。 [0004]光不仅作为能量影响光合作用， 而且作为信号调控植物的生长发育。 光敏色素是 红光和远红光的光受体， 光敏色素作用因子PIFs位于光敏色素的下游， 在调控种子的萌发、 幼苗的光形态建成、 参与避荫反应和响应逆境胁迫等方面具有重要的功能。 如PIF1参与调说　明　书 1/6 页 3 CN 114836432 A 3