(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210378771.9 (22)申请日 2022.04.12 (71)申请人 无锡市第九人民医院 地址 214000 江苏省无锡市梁 溪路999号 (72)发明人 王秋波　刘庆阳　钱希铭　殷剑　 褚莹　姜风英　 (74)专利代理 机构 北京和联顺知识产权代理有 限公司 1 1621 专利代理师 苏映惜 (51)Int.Cl. C12Q 1/6851(2018.01) C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6837(2018.01) C12N 15/11(2006.01) G16B 15/30(2019.01) (54)发明名称 一种外周血DMARDs耐药相关的标志物的筛 选方法 (57)摘要 本发明公开了一种外周血DMARDs耐药相关 的标志物的筛选方法， 属于生物医学技术领域， 步骤为： 通过生物信息学方法初步筛选与RA治疗 药物耐药相关的外周血标志物； 利用临床样本对 初步筛选的耐药标志物进行验证， 明确其表达水 平与药物治疗 敏感性之间的关系； 采用流式细胞 技术分离外周血细胞中不同有核细胞亚群， 对不 同亚群细胞进行耐药标志物表达量检测， 建立RA 药物治疗耐药标志物检测方法； 选取临床未接受 药物治疗的RA患者进行前瞻性实验验证， 验证已 建立检测方法的有效性， 明确其转化临床应用的 可行性。 本发明保证了候选标志物的可靠性， 以 患者外周血为样本建立有效简单的RA耐药标志 物检测方法， 并以前瞻性实验 验证其可靠性。 权利要求书2页 说明书6页 附图10页 CN 114703260 A 2022.07.05 CN 114703260 A 1.一种外周血DMARDs耐药相关的标志 物的筛选方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： 步骤1： 筛选生物制剂DMA RDs药物治疗耐药标志物， 通过生物信息学方法初步筛选与RA 治疗药物耐药相关的外周血 标志物； 步骤2： 候选标志物临床样本验证， 利用临床样本对初步筛选的耐药标志物进行验证， 明确其表达水平与药物治疗敏感性之间的关系； 步骤3： 建立药物敏感性标志物检测方法， 采用流式细胞技术分离外周血细胞中不同有 核细胞亚群， 对不同亚群细胞进行耐药标志物表达量检测， 建立RA药物治疗耐药标志物检 测方法， 并优化标志 物检出效率； 步骤4： 药物敏感性标志物检测方法临床验证， 选取临床未接受药物治疗的RA患者进行 前瞻性实验 验证， 验证已建立检测方法的有效性， 明确其 转化临床应用的可 行性。 2.如权利 要求1所述的外周血DMA RDs耐药相关的标志物的筛选方法， 其特征在于， 步骤 1的具体步骤为： GEO数据库筛选接受生物制剂DMARDs药物治疗RA患者外周血基因表达谱芯 片， 分别对不同生物制剂D MARDs药物治疗后临床缓解症状为标准， 区分耐药 组与敏感组， 并 利用生物信息学方法筛选不同组别中耐药患者与敏感患者外周血中表达水平具有显著差 异的基因， 通过 互作分析、 免疫细胞浸润分析、 以及基因功能分析筛选出关键节点基因为候 选耐药相关标志 物。 3.如权利 要求2所述的外周血DMARD s耐药相关的标志物的筛选方法， 其特征在于， 对RA 治疗药物耐药特征性芯片数据进 行标准化转换并进行差异分析， 差异标准选取log2  FC>1, p<0.05， 对所有满足差异筛选标准的基因进行基因功能富集分析， 并利用生物信息学工具 进行蛋白互作分析， 并采用三种模式进行关键节点基因筛选， 三种算法均取排名前30个基 因为关键节点基因并对其进行合成分析， 选择 所有算法重 叠基因为初步筛 选标志物。 4.如权利 要求1所述的外周血DMA RDs耐药相关的标志物的筛选方法， 其特征在于， 步骤 2的具体步骤为： 对候选标志物进行 临床样本验证， 以临床 接受DMARDs治疗RA患者外周血为 样本， 采用荧光定量P CR方法对候选标志物进 行基因扩增， 通过对比治疗药物敏感性不同的 患者， 验证候选基因的可靠性， 对通过验证的候选基因进行表达量分析， 明确候选基因表达 水平与药物治疗敏感性之间的相关性。 5.如权利 要求4所述的外周血DMA RDs耐药相关的标志物的筛选方法， 其特征在于， 利用 临床样本对初步筛选标志物进 行荧光定量P CR表达量检测， 检测结果与筛选 芯片数据对比， 留取表达量趋势与芯片数据相同， 并在耐药和敏感样本之 间存在显著性差异的标志物进 行 后续验证。 6.如权利 要求1所述的外周血DMA RDs耐药相关的标志物的筛选方法， 其特征在于， 步骤 3的具体步骤为： 利用流式细胞技术分选RA患者外周血细胞不同有核细胞亚群， 利用荧光定 量PCR方法检测不同细胞亚群中候选标志物的表达水平， 以提高候选基因检出敏感性， 并计 算耐药检出差异标准， 明确不同标志物的耐药检出阈值， 以流式细胞技术和荧光定量P CR技 术为基础建立DMARDs治疗敏感性标志 物预测方法。 7.如权利 要求6所述的外周血DMA RDs耐药相关的标志物的筛选方法， 其特征在于， 新鲜 RA患者外周血样本， 去除血清后， 进行有核细胞分离， 获取外周血有核细胞后， 利用流失细 胞技术对有核细胞成分进行分选， 分离B细胞、 CD4 +T细胞、 CD8+T细胞、 单核细胞、 巨噬细胞、 中性粒细胞， 并分别对亚细胞群进 行标志物荧光定量P CR表达量检测， 明确各细胞亚群之间权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114703260 A 2表达量差异， 选取表达量差异最大细胞亚群建立RA耐药敏感性标志物检测方法， 优化实验 条件， 确定检测阈值。 8.如权利 要求1所述的外周血DMA RDs耐药相关的标志物的筛选方法， 其特征在于， 步骤 4的具体步骤为： 临床选择未接受过任何RA药物治疗的患者留取外周血样 本， 利用已建立的 方法进行药物敏感性预测， 对候选标志物再次进行验证， 并检验其检测方法的有效性和可 靠性。 9.如权利 要求8所述的外周血DMA RDs耐药相关的标志物的筛选方法， 其特征在于， 按照 已建立的RA药物敏感性标志物检测方法分离患者外周血有核细胞亚群， 并进 行相应标志物 荧光定量PCR表达量检测， 预测患者药物治疗敏感性， 待患者接受完整药物治疗周期后， 所 有入选患者遵循临床用药指南进 行RA药物干预， 治疗周期结束后采用欧洲抗风湿联盟标准 对治疗效果进行评估， 将所有患者分类为药物敏感、 部分敏感、 耐药三组， 与预测结果进行 对比， 明确建立方法转 化临床可 行性。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114703260 A 3