(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210379468.0 (22)申请日 2022.04.12 (71)申请人 台州学院 地址 318000 浙江省台州市 市府大道1 139 号 申请人 磐安县中药创新发展研究院 (72)发明人 陈露茜　李钧敏　泮杭凯　杨党　 邓惠敏　徐凯玠　陈文斌　 (74)专利代理 机构 浙江海贸律师事务所 3 3347 专利代理师 曹理尚 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/94(2006.01) (54)发明名称 同步检测东贝母中4种植物病毒基因的引物 以及检测方法 (57)摘要 本发明涉及一种同步检测东贝母中4种植物 病毒基因的引物以及利用该引物的检测方法， 属 于植物病毒检测技术领域， 所述的引物由4种植 物病毒基因的引物制作而成， 所述的检测方法包 括东贝母植株叶片选取过程、 提取总RNA过程、 反 转录制备cDNA过程， 多重PCR扩增过程、 凝胶电泳 检测过程； 本发明通过设计东贝母中4种常见病 毒的特异性引物， 并设置引物浓度及PCR反应条 件， 可以一次性检测东贝母中是否存在浙贝母花 叶病毒、 百合斑驳病毒、 浙贝母Y病毒和Hop   yellow virus病毒； 本发明设置的引物对病毒的 特异性强， 检测方法快速、 简便、 准确， 在东贝母 种植过程中可以进行有效检测植物病害情况， 及 时采取有效措施， 减少病害损失。 权利要求书3页 说明书8页 附图2页 CN 114990259 A 2022.09.02 CN 114990259 A 1.一种同步检测东贝母中4种植物病 毒基因的引物， 其特征在于， 所述的引物包括用于 检测浙贝母花叶病毒基因的浙贝母花叶病毒引物， 用于检测百合斑驳病毒基因的百合斑驳 病毒引物， 用于检测浙贝母Y病毒基因的浙贝母Y病毒引物， 用于检测Hop  yellow virus病 毒基因的Hop  yellow virus病毒引物； 所述的浙贝母花叶病毒引物为： TFMV‑F： 5’ ‑GCAAAGAATAAACGTCAGAGACAGA ‑3'， TFMV‑R： 5’ ‑TTCAAACACTAAACTCTCGGTTTCTTTCT‑3'， 所述的百合斑驳病毒引物为： LMoV‑F： 5’ ‑‑TCGGGCCCAGGCGATAAATT‑3'， LMoV‑R： 5’ ‑‑GCCGACCTGGTAGTGCT TCA‑3'， 所述的浙贝母Y病毒引物为： FVY‑F： 5’ ‑‑AGCAGGTCAGTTTACAAAGGACT‑3'， FVY‑R： 5’ ‑‑CTGGACTGCCACTGTGTCAC ‑3'， 所述的Hop  yellow virus病毒引物为： HYV‑F： 5’ ‑‑TTGACGACAGACTACGATCT TCCATTG‑3'， HYV‑R： 5’ ‑‑ACTCGGTAACGCAACTCAGAACATC‑3'。 2.根据权利要求1所述的同步检测东贝母中4种植物病毒基因的引物， 其特征在于： 所 述的浙贝母花叶病毒引物的上游引物序列为GCAAAGAATAAA CGTCAGAGA CAGA， 长度为2 5bp， GC 含量为40％， Tm值为54.60℃； 下游引物序列为TTCAAACACTAAACTCTCGGTTTCTTTCT， 长度为 29bp， GC含量 为34.48％， Tm值 为55.67℃。 3.根据权利要求1所述的同步检测东贝母中4种植物病毒基因的引物， 其特征在于： 所 述的百合斑驳病毒引物的上游引物序列为TCGGGCCCAGGCGATAAATT， 长度为20bp， GC含量为 55.00％， Tm值为59.72℃； 下游引物序列为GCCGACCTGGTAGTGCTTCA， 长度为20bp， GC含量为 60.00％， Tm值 为60.36℃。 4.根据权利要求1所述的同步检测东贝母中4种植物病毒基因的引物， 其特征在于： 所 述的浙贝母Y病 毒引物的上游引物序列为AGCAGGTCAGTTTACAAAGGACT， 长度为23bp， GC含量 为43.48％， Tm值为55.85℃； 下游引物序列为CTGGACTGCCACTGTGTCAC， 长度为20bp， GC含量 为60.00％， Tm值 为59.01℃。 5.根据权利要求1所述的同步检测东贝母中4种植物病毒基因的引物， 其特征在于： 所 述的Hop yellow virus病毒引物的上游引物序列为TTGACGACAGACTACGATCTTCCATTG， 长度 为27bp， GC含量为44.44％， Tm值为58.16℃； 下游引物序列为ACTCGGTAA CGCAACTCAGAACATC， 长度为25bp， GC含量 为48％， Tm值 为59.09℃。 6.一种利用权利要求1至5 中任一项所述的同步检测东贝母中4种植物病 毒基因的引物 的检测方法， 其特 征在于： 所述的检测方法包括以下步骤： 步骤一： 叶片选取 过程： 选取新鲜的东贝母植株叶片； 步骤二： 提取总RNA过程： 利用RNAprep  Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒的提取方 法提取东贝母植株叶片中的总RNA； 步骤三： 反转录过程： 以提取的东贝母病毒基因的总RNA为模板， 反转录为东贝母病毒 基因的cDNA；权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114990259 A 2步骤四： 多重PCR扩增过程： 以cDNA为模板， 在EP管内把下列4对合成的引物放入混匀配 制反应体系， 通过预变性 ‑变性‑退火‑延伸‑保温的循环过程， 进行多重PCR扩增反应程序， 得到扩增产物； 所述的引物为： 浙贝母花叶病毒引物： TFMV‑F： 5’ ‑GCAAAGAATAAACGTCAGAGACAGA ‑3'， TFMV‑R： 5’ ‑TTCAAACACTAAACTCTCGGTTTCTTTCT‑3'， 百合斑驳病毒引物： LMoV‑F： 5’ ‑‑TCGGGCCCAGGCGATAAATT‑3'， LMoV‑R： 5’ ‑‑GCCGACCTGGTAGTGCT TCA‑3'， 浙贝母Y病毒引物： FVY‑F： 5’ ‑‑AGCAGGTCAGTTTACAAAGGACT‑3'， FVY‑R： 5’ ‑‑CTGGACTGCCACTGTGTCAC ‑3'， Hop yellow virus病毒引物： HYV‑F： 5’ ‑‑TTGACGACAGACTACGATCT TCCATTG‑3'， HYV‑R： 5’ ‑‑ACTCGGTAACGCAACTCAGAACATC‑3'； 步骤五： 凝胶电泳检测过程： 用琼脂粉末、 TBE电泳缓冲液配制1.2％琼脂糖凝胶， 取5 μl   PCR产物在水平电泳槽中进行电泳， 稳压7.5V/cm电泳， 待溴酚蓝迁移至凝胶长度的1/2～2/ 3处结束电泳， 在凝胶成像系统中观察并分析； 同步检测的4种病毒为浙贝母花叶病毒、 百合斑驳病毒、 浙贝母Y病毒和Hop  yellow  virus病毒。 7.根据权利要求6所述的检测方法， 其特征在于： 所述的步骤四多重PCR扩增过程中， 多 重PCR扩增反应 体系设置为： 25 μl 2×Phusion Master Mix， 所述的TFMV ‑F引物浓度设置为10 μmo l/L， 体积设置为2 μl ‑4 μl， 所述的TFMV ‑R引物浓度设置为10 μmo l/L， 体积设置为2 μl ‑4 μl， 所述的LMoV ‑F引物浓度设置为10 μmo l/L， 体积设置为1.5 μl ‑3 μl， 所述的LMoV ‑R引物浓度设置为10 μmo l/L， 体积设置为1.5 μl ‑3 μl， 所述的FVY ‑F引物浓度设置为10 μmo l/L， 体积设置为1.5 μl ‑3 μl， 所述的FVY ‑R引物浓度设置为10 μmo l/L， 体积设置为1.5 μl ‑3 μl， 所述的HYV‑F引物浓度设置为10 μmo l/L， 体积设置为1.5 μl ‑3 μl， 所述的HYV‑R引物浓度设置为10 μmo l/L， 体积设置为1.5 μl ‑3 μl， 反转录产物作为cDNA模板， 浓度设置为 4 μl‑6 μl， 其余用ddH2O补充至50 μl。 8.根据权利要求7所述的检测方法， 其特征在于： 所述的多重PCR扩增反应体系设置为： 25 μl 2×Phusion Master Mix， 所述的TFMV ‑F引物浓度设置为10 μmo l/L， 体积设置为3 μl， 所述的TFMV ‑R引物浓度设置为10 μmo l/L， 体积设置为3 μl， 所述的LMoV ‑F引物浓度设置为10 μmo l/L， 体积设置为2 μl， 所述的LMoV ‑R引物浓度设置为10 μmo l/L， 体积设置为2 μl，权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 114990259 A 3