(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210381164.8 (22)申请日 2022.04.12 (71)申请人 深圳海普洛斯医学检验实验室 地址 518000 广东省深圳市南 山区西丽 街 道松坪山路1号源兴科技大厦南座 1106 (72)发明人 许明炎　张晓妮　周书雄　 (74)专利代理 机构 深圳鼎合诚知识产权代理有 限公司 4 4281 专利代理师 李小焦　彭家恩 (51)Int.Cl. C12Q 1/6806(2018.01) C40B 50/06(2006.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种人免疫组库测序的方法及试剂盒 (57)摘要 本申请公开了一种人免疫组库测序的方法 及试剂盒。 本申请方法包括， 用第一引物对模板 核酸进行一次延伸； 第一引物包括平台上游引物 结合区、 UMI和靶标上游引物序列， 其部分T替换 为dU； 向反应体系加入第二引物进行一次延伸； 第二引物包括平台下游引物结合区和靶标下游 引物序列； 向反应体系加入UDG/U NG酶消化dU； 消 化后向反应体系加入第三引物进行PCR； 第三引 物为第一引物平台上游引物结合区序列； 第一和 第二引物的靶 标序列为针对人TCR基因设计的特 异性序列。 本申请方法全覆盖人免疫组库TCR的 CDR3， 捕获效率高； 通过引物的特殊 设计， 依序向 反应体系中加入三种引物， 实现使每个原始模板 核酸只对应一个UMI， 校正每个靶点扩增性偏差， 实现靶标基因拷贝数定量检测。 权利要求书2页 说明书15页 序列表19页 CN 114774517 A 2022.07.22 CN 114774517 A 1.一种人免疫组库测序的方法， 其特 征在于： 包括以下步骤， 配制反应体系， 采用第一引物对模板核酸进行一 次延伸， 得到互补链； 所述第 一引物由 5’端到3’端依序包括测序平台上游引物结合区、 唯一性标识符和靶标特异性上游引物序 列； 并且， 所述第一引物中， 测序 平台上游引物结合区和靶标特异性上游引物序列中的碱基 T替换为脱氧尿嘧啶， 所述测序平台上游引物结合区对应测序平台的上游测序引物的3 ’末 端； 第一引物延伸结束后， 向反应体系中加入第二引物， 利用第二引物对第一引物延伸的 互补链进 行一次延伸， 获得由测序平台上游引物结合区、 唯一性标识符、 靶标序列和测序 平 台下游引物结合区组成的产 物； 所述第二引物由5 ’端到3’端依序包括测序 平台下游引物结 合区和靶标特异 性下游引物序列， 所述测序 平台下游引物结合区对应测序 平台的下游测序 引物的3’末端； 第二引物延伸结束后， 向反应体系中加入UDG/UNG酶消化脱氧尿嘧啶， 从而消化第一引 物以及第一引物的延伸链； UDG/UNG酶消化完成后， 向反应体系中加入第三引物， 利用第三引物和第二引物对第二 引物延伸的产物进行PCR扩增富集， 获得所述模板核酸的所有扩增子都添加相同唯一性标 识符的产 物； 所述第三引物为第一引物的测序平台上游引物结合区自5 ’端起的全部或部分 序列， 并且， 第三引物中的碱基T不被替换为脱氧尿嘧啶； 对PCR扩增富集获得的所有扩增子都添加相同唯一性标识符的产物进行测序文库构建 和测序， 即完成人免疫组库测序； 所述靶标特异性上游引物序列和所述靶标特异性下游引物序列为针对人T细胞受体编 码基因设计的全覆盖其CDR3区域编码基因序列的特异性引物序列。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于： 所述靶标特异性上游引物序列为针对人T 细胞受体β 链的V基因设计的特异性引物序列； 所述靶标特异性下游引物序列为针对人T细胞受体β链的J基因设计的特异性引物序 列； 通过所述靶标特异性上游引物序列和所述靶标特异性下游引物序列的扩增能够全覆 盖T细胞受体β 链的CDR3区域编码基因。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于： 所述第一引物中， 唯一性标识符的序列中 插入有至少一个脱氧尿嘧啶， 通过插入脱氧尿嘧啶的分隔， 使得唯一性标识符的连续碱基 数量小于 5； 优选的， 所述PCR扩增富 集的扩增循环数 大于或等于 5。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于： 所述第一引物由Seq  ID No.1至Seq  ID  No.40所示序列的40条引物组成； 优选的， 所述第二引物由Seq  ID No.41至Seq  ID No.52所示序列的12条引物组成； 优选的， 所述第三引物为Seq  ID No.53所示序列。 5.根据权利要求1 ‑4任一项所述的方法， 其特征在于： 所述测序文库构建包括以下步 骤， 对所述PCR扩增富集获得的所有扩增子都添加相同唯一性标识符的产物进行纯化， 获 得纯化产物；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114774517 A 2采用第四引物和第五引物， 对纯化产物进行建库扩增， 获得测序文库； 所述第四引物为 带有测序接头和Barcode的测序平台上游测序引物， 所述第五引物为带有测序接头和 Barcode的测序平台下游测序引物。 6.根据权利要求5所述的方法， 其特 征在于： 所述第四引物为Seq  ID No.54所示序列； 优选的， 所述第五引物为Seq  ID No.55所示序列。 7.一种人免疫组库测序的试剂盒， 其特征在于： 包括第一引物、 第二引物、 第三引物和 UDG/UNG酶； 所述第一引物由5 ’端到3’端依序包括测序平台上游引物结合区、 唯一性标识符和靶标 特异性上游引物序列； 并且， 所述第一引物中， 测序 平台上游引物结合区和靶标特异性上游 引物序列中的碱基T替换为脱氧尿嘧啶， 所述测序平台上游引物结合区对应测序平台的上 游测序引物的3 ’末端； 所述第二引物 由5’端到3’端依序包括测序平台下游引物结合区和靶标特异性下游引 物序列， 所述测序平台下游引物结合区对应测序平台的下游测序引物的3 ’末端； 所述第三引物为第一引物的测序平台上游引物结合区自5 ’端起的全部或部分序列， 并 且， 第三引物中的碱基T不被替换为脱氧尿嘧啶； 所述靶标特异性上游引物序列和所述靶标特异性下游引物序列为针对人T细胞受体编 码基因设计的全覆盖其CDR3区域编码基因序列的特异性引物序列。 8.根据权利要求7所述的试剂 盒， 其特征在于： 所述靶标特异性上游引物序列为针对人 T细胞受体β 链的V基因设计的特异性引物序列； 所述靶标特异性下游引物序列为针对人T细胞受体β链的J基因设计的特异性引物序 列； 通过所述靶标特异性上游引物序列和所述靶标特异性下游引物序列的扩增能够全覆 盖T细胞受体β 链的CDR3区域编码基因； 优选的， 所述第 一引物中， 唯一性标识符的序列中插入有至少一个脱氧尿嘧啶， 通过插 入脱氧尿嘧啶的分隔， 使得唯一 性标识符的连续碱基数量小于 5。 9.根据权利要求7所述的试剂盒， 其特征在于： 所述第一引物由Seq  ID No.1至Seq  ID  No.40所示序列的40条引物组成； 优选的， 所述第二引物由Seq  ID No.41至Seq  ID No.52所示序列的12条引物组成； 优选的， 所述第三引物为Seq  ID No.53所示序列。 10.根据权利要求7 ‑9任一项所述的试剂盒， 其特 征在于： 还 包括第四引物和第五引物； 所述第四引物为带有测序接头和Barcode的测序平台上游测序引物， 所述第五引物为 带有测序接 头和Barcode的测序平台下游测序引物； 优选的， 所述第四引物为Seq  ID No.54所示序列； 优选的， 所述第五引物为Seq  ID No.55所示序列。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114774517 A 3