(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210375088.X (22)申请日 2022.04.11 (71)申请人 福建师范大学 地址 350108 福建省福州市闽侯县上街 镇 大学城福建师 范大学科技处 (72)发明人 李芹　张怀东　黄建忠　臧珊珊　 汪伟航　林涛　郝倩　 (74)专利代理 机构 福州君诚知识产权代理有限 公司 35211 专利代理师 戴雨君 (51)Int.Cl. G01N 33/569(2006.01) G01N 33/53(2006.01) G01N 33/58(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种适用 于链霉菌活细胞的功能核酸探针 导入方法及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种适用于链霉菌活细胞的 功能核酸探针导入方法， 本发明首先构建了四环 素特异性分子信标核酸探针FAM ‑Tc‑BHQ1， 然后 将FAM‑Tc‑BHQ1与穿膜肽KH9‑BP100于室温进行 混合孵育， 制备穿膜肽 ‑核酸适配体分子信标复 合物， 并且提供了一种适用于链霉菌活细胞的功 能核酸探针导入 方法。 本发明以四环素类抗生素 产生菌金色链霉菌为模型， 开展了穿膜肽介导的 四环素特异性分子信标的活细胞载运及靶标检 测研究。 本发 明采用穿膜肽非共价偶联四环素特 异性分子信标， 实现了分子信标的金色链霉菌活 细胞载运及胞内四环素的单细胞水平活细胞荧 光检测。 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 114814207 A 2022.07.29 CN 114814207 A 1.四环素特异性分子信标核酸探针FAM ‑Tc‑BHQ1， 其特征在于： 序列如下： 5 ’ ‑FAM‑CCG GCGGGCCCCCGGCAGGCCACGGCTTGGGTTGGTCCCACTGCGCGTC CCGCCGG‑BHQ1‑3’。 2.一种穿膜肽 ‑核酸适配体分子信标复合物的制备方法， 其特征在于： 将权利要求1所 述的FAM‑Tc‑BHQ1与穿膜肽KH9‑BP100于室温进行混合孵 育。 3.根据权利要求2所述的一种穿膜肽 ‑核酸适配体分子信标复合物的制备方法， 其特征 在于： 所述FAM ‑Tc‑BHQ1与KH9‑BP100的摩尔浓度比为5 μM∶25 ‑150 μM。 4.根据权利要求2所述的一种穿膜肽 ‑核酸适配体分子信标复合物的制备方法， 其特征 在于： 所述孵 育时间为3 0‑60min。 5.一种适用于链霉菌活细胞的功能核酸探针导入方法， 其特 征在于： 包括如下步骤： (1)将1μL  FAM‑aptamer/FAM ‑Tc‑BHQ1加入至终体积100 μL的缓冲液溶液中， 95℃变性 10min， 自然冷却到室温30min， 在上述体系中添加1.5 μL  KH9‑BP100， 室温孵育30 ‑60min以 形成穿膜肽 ‑核酸适配体分子信标复合物， 将穿膜肽 ‑核酸适配体分子信标复合物与细胞在 34℃避光孵 育60min。 6.根据权利要求5所述的一种适用于链霉菌活细胞的功能核酸探针导入方法， 其特征 在于： 所述FAM ‑aptamer/FAM ‑Tc‑BHQ1的浓度为5 0 μM， 所述KH9‑BP100的浓度为5mM 。 7.根据权利要求5所述的一种适用于链霉菌活细胞的功能核酸探针导入方法， 其特征 在于： 所缓冲液溶液中NaCl的终浓度为200mM， Tris ‑HCl的终浓度为20mM,缓冲溶液的pH为 7.2。 8.根据权利要求5所述的一种适用于链霉菌活细胞的功能核酸探针导入方法， 其特征 在于： 吸附在细胞上未进入细胞内部的穿膜肽 ‑核酸适配体分子信标复合物以0.25％胰蛋 白酶在37℃消化5mi n， 并用上述缓冲液 溶液洗涤2次。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114814207 A 2一种适用于链 霉菌活细胞的功能核酸探针导入方 法及其应用 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种适用于链霉菌 活细胞的功能核酸探针导 入方法。 背景技术 [0002]核酸适配体分子信标(Molecular  becon)是一种根据荧光共振能量转移原理构建 的功能核酸(Functional  Nucleic Acid)生物传 感器。 核酸适配体分子信标具有典型的茎 环结构： 包括一个可特异性识别靶标物质的核酸适配体环 区， 和分别连接有荧光基团和淬 灭基团、 并且碱基序列互补的两个茎区。 当体系中不存在待检测靶标时， 核酸适配体分子信 标茎区碱基发生互补， 荧光基团和淬灭基团的距离十分接近(＜10nm)， 荧光基团与淬灭基 团二者之 间发生荧光共振能量转移， 荧光几乎完全被淬灭。 相反， 当体系中存在待检测靶标 时， 核酸适配体环区与靶标发生结合， 修饰有荧光基团和淬灭接团的茎区打开， 使 得二者相 互远离， 荧 光恢复。 体系的荧 光强度与靶标分子的浓度呈正相关。 [0003]近年来， 分子信标已经在动 物活细胞内靶标物质的实时在线检测中具有广泛的应 用。 以分子信标生物传感器进行靶标检测方法简单易行， 无需对待检测细胞进行基因工程 改造以组装识别、 报告元件， 也无需开展确保两组原件行驶正常功能的体内互作研究及改 造工作。 目前， 已经在动物活细胞中实现了基于分子信标的多种靶标示踪检测， 如病毒基因 组、 蛋白质、 ATP等。 可采用诸如病毒 载体、 脂质分子、 细胞穿膜肽、 纳米材料等辅助跨膜运载 系统将核酸适配体运输至细胞内部， 或采用含有细胞 受体识别与靶标识别双功能的嵌合适 配体经受体介导的内吞进入细胞。 [0004]建立基于核酸适配体分子信标检测微生物活细胞胞内靶标的方法， 将为在生理条 件下更好地了解微生物代谢产 物合成途径提供帮助， 更是实现微生物单个活细胞水平生理 生化研究的趋势所向。 应用微生物活细胞代谢产物生物传感器， 可在单细胞层次实现胞内 代谢产物的快速浓度响应， 有助于实现菌种代谢途径的活细胞解析和高产菌株的快速筛 选， 在工业菌种高通 量筛选领域展现了良好的应用前 景。 [0005]但目前， 功能核酸生物传感器在微生物活细胞代谢产物检测中的应用受限。 究其 原因， 可能是微生物细胞除细胞膜屏障外还具有复杂的细胞壁结构， 同时微生物细胞不具 有内吞作用， 其摄取外界物质的方式与动物细胞也不尽相同。 目前， 尚缺少适用于微生物细 胞的核酸适配体辅助跨膜运载系统。 建立针对特定微生物细胞类型的适配体辅助跨膜运载 系统， 将为实现 “点亮”微生物活细胞代谢产物奠定基础。 发明内容 [0006]本发明的目的在于提供一种适用于链霉菌活细胞的功能核酸探针导入方法。 [0007]为实现上述目的， 本发明采用如下技 术方案： [0008]本发明首 先提供一种四环素 特异性分子信标核酸探针FAM ‑Tc‑BHQ1， 其序列如下： [0009]5’ ‑FAM‑CCGGCGGGCCCCCGGCAGGCCACGGCTTGGGTTGGTCCCACTGCGCGTCCCGCCGG ‑BHQ1‑说　明　书 1/4 页 3 CN 114814207 A 3