(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210372453.1 (22)申请日 2022.04.11 (71)申请人 山东省寿光市三木种苗有限公司 地址 262703 山东省潍坊市寿光市区圣城 路中段 申请人 山东省西甜瓜 育种工程 技术研究中 心有限公司 　 东北农业大 学 (72)发明人 刘树森　栾非时　刘钊　刘识　 宋正峰　高鹏　郎丰孝　刘宏宇　 冯翠艳　朱子成　马鸿艳　 (74)专利代理 机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权 代理有限公司 2321 1 专利代理师 邓宇(51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) A01H 1/04(2006.01) (54)发明名称 鉴定西瓜心室数的分子标记、 方法、 引物对、 试剂盒及其应用 (57)摘要 鉴定西瓜心室数的分子标记、 方法、 引物对、 试剂盒及其应用， 属于分子标记辅助育种技术领 域。 为了更好地培育不同果实形状的西瓜或鉴定 西瓜心室数， 本发明提供了一种与西瓜心室数紧 密连锁的分子标记， 该分子标记存在一处SNP位 点的变化， 不存在突变的位点会被限制性内切酶 MspⅠ切开。 通过引物对对西瓜幼苗基因组DNA进 行PCR扩增， 利用限制性内切酶Msp Ⅰ对扩增产物 进行酶切， 最终通过琼脂糖凝胶电泳对酶切产物 进行鉴定即可对3心室和5心室西瓜材料进行区 分。 上述鉴定方法， 操作简便， 准确度高， 为西瓜 果实形状分子标记辅助选择育种提供了行之有 效的育种工具及技 术。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图1页 CN 114807414 A 2022.07.29 CN 114807414 A 1.一种与西瓜心室数紧密连锁的分子标记， 其特征在于， 所述分子标记为核苷酸序列 如SEQ ID NO.1所示的685bp核苷酸片段或核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示的685bp核苷酸 片段； 所述SEQ  ID NO.1与5心室性状紧密连锁， 所述SEQ  ID NO.2与3心室性状紧密连锁。 2.引物对和限制性内切酶Msp Ⅰ在鉴定西瓜心室数中的应用， 其特征在于， 所述引物对 包括核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示的上游引物和 核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示的下游 引物， 所述应用为利用引物对扩增西瓜基因组DNA获得扩增产 物， 再利用限制性内切酶M spⅠ 酶切扩增产物， 根据酶切产物来 鉴定西瓜心室数。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于， 所述西瓜基因组DNA取自幼苗期、 抽蔓期或 结果期的任一 一个时期。 4.根据权利要求2所述的应用， 其特 征在于， 所述 鉴定西瓜心室数为3心室或5心室。 5.一种鉴定西瓜心室数的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： (1)提取待测西瓜的基因 组DNA； (2)以步骤(1)获得的基因组DNA为模板， 利用引物对进行PCR扩增， 获得PCR产物； 所述 引物对包括核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示 的下游引物； (3)用限制性内切酶Msp Ⅰ对步骤(2)获得的PCR产物进行酶切， 获得酶切产物； (4)通过检测酶切产物， 判断西瓜的心室数。 6.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于， 步骤(4)所述判断方法为利用琼脂糖凝胶 电泳检测酶切产 物， 若酶切产 物具有或包含68 5bp的片段， 则判断西瓜具有3心室性状； 若酶 切产物不具有685bp的片段， 则判断西瓜具有5心室性状。 7.权利要求5或6任意一项所述的方法在西瓜心室数辅助鉴定、 辅助育种及西瓜心室数 筛选中的应用。 8.一种用于鉴定西瓜心室数性状的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒含有引物对和限 制性内切酶Msp Ⅰ； 所述引物对包括核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示的上游引物和核苷酸序 列如SEQ ID NO.4所示的下游引物。 9.一种权利要求8所述的试剂 盒的使用方法， 其特征在于， 利用所述引物对对西瓜基因 组DNA进行扩增， 获得PCR产物， 再利用限制性内切酶Msp Ⅰ对获得的PCR产物进行酶切。 10.权利要求8所述的试剂盒在西瓜心室数辅助鉴定、 辅助育种及西瓜心室数筛选中的 应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807414 A 2鉴定西瓜心室数的分子标记、 方 法、 引物对、 试剂盒及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及鉴定西瓜心室数的分子标记、 方法、 引物对、 试剂盒及其应用， 属于分 子标记辅助育种技 术领域。 背景技术 [0002]西瓜(Citrullus  lanatus)为葫芦科西瓜属一年蔓生草本植物， 在我国及世界范 围内广泛栽培， 是世界上重要的水果型 蔬菜之一。 心室数对西 瓜果实形状具有很大影响， 普 通栽培种西瓜多为3心室或者4心室， 果实为椭圆形和圆形； 饲用西瓜一般为5心室西瓜， 果 实呈扁圆形。 心室数是影响果 实形状的关键性状， 对西瓜的商品性具有较大影响。 在 多数园 艺作物中， CLV3是影响心室数的主要基因， 本发明在前期研究中发现， 西瓜中CLV3并不是导 致其心室数发生变化的主要基因。 因此， 为了培育相应性状的西 瓜或鉴定西 瓜心室数， 亟需 找到影响西瓜心室数的关键基因。 [0003]CAPS分子标记是由于酶切位点处发生单碱基突变， 致使酶切后产生片段长度多态 性的一种分子标记， 该类标记在基因组中分布广泛， 操作简便， 结果易于观察， 在相同物种 不同材料中具有普遍适用性。 发明内容 [0004]为了更好地培育相应形状的西瓜或鉴定西瓜心室数， 获得与西瓜心室数紧密连锁 的染色体区段及分子标记， 本发明提供了一种与西瓜心室数紧密连锁的分子标记， 所述分 子标记为核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示的685bp核苷酸片段或核苷酸序列如SEQ  ID NO.2 所示的685bp核苷酸片段； 所述SEQ  ID NO.1与5心室性状紧密连锁， 所述SEQ  ID NO.2与3心 室性状紧密连锁。 [0005]本发明还提供了引物对和限制性内切酶Msp Ⅰ在鉴定西瓜心室数中的应用， 所述引 物对包括核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示的上游引物和 核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示的 下游引物， 所述应用为利用引物对扩增西 瓜基因组DNA获得扩增产 物， 再利用限制性内切酶 MspⅠ酶切扩增产物， 根据酶切产物来 鉴定西瓜心室数。 [0006]进一步地限定， 所述西瓜基因组DNA取自幼苗期、 抽蔓期或结果期的任一一个时 期。 [0007]进一步地限定， 所述 鉴定西瓜心室数为3心室或5心室。 [0008]本发明还提供了一种鉴定西瓜心室数的方法， 该 方法包括如下步骤： [0009](1)提取待测西瓜的基因 组DNA； [0010](2)以步骤(1)获得的基因组DNA为模板， 利用引物对进行PCR扩增， 获得PCR产物； 所述引物对包括核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ  ID NO.4 所示的下游引物； [0011](3)用限制性内切酶Msp Ⅰ对步骤(2)获得的PCR产物进行酶切， 获得酶切产物； [0012](4)通过检测酶切产物， 判断西瓜的心室数。说　明　书 1/6 页 3 CN 114807414 A 3