(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210370683.4 (22)申请日 2022.04.11 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114457198 A (43)申请公布日 2022.05.10 (73)专利权人 潍坊华卓生物科技有限公司 地址 261100 山东省潍坊市经济开发区北 海路2333号潍坊万创空间一期3座商 务办公楼102室 专利权人 潍坊吉因生物科技有限公司 　 贝南生物科技 （厦门） 有限公司 　 潍坊华英生物科技有限公司 　 昌乐县宝都街道社区卫 生服务中 心 (72)发明人 王羲笛　王宏华　张勇　童超　陈智林　辛瑞祥　刘磊　王小彩　 翟坤龙　 (74)专利代理 机构 威海恒誉润达专利代理事务 所(普通合伙) 3726 0 专利代理师 戚笑颐 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) 审查员 田颖 (54)发明名称 一种甲型流感病毒及多分型的检测试剂盒 及检测方法 (57)摘要 本发明提供了一种甲型流感病毒及多分型 的检测试剂盒及检测方法， 其解决了现有的甲型 流感病毒及多分型检测手段存在检测时间长、 灵 敏度低、 操作步骤繁琐且易发生交叉污染的技术 问题， 检测试剂盒包含FluA/H579反应试剂， FluA/H579反应试剂包含甲型流感病毒及H5、 H7、 H9分型特异性引物、 甲型流感病毒及H5、 H 7、 H9探 针、 缓冲液、 酶混合液和冻干保护剂。 本发明同时 提供与甲型流感病毒及多分型的检测试剂盒联 合的多重荧光PCR检测方法。 本发明可广泛应用 于生物信息 检测技术领域。 权利要求书1页 说明书9页 序列表3页 附图7页 CN 114457198 B 2022.07.12 CN 114457198 B 1.一种甲型流感病毒及多分型的检测试剂盒， 其特征在于， 包含FluA/H579反应试剂， 所述FluA/H579反应试剂为冻干粉状试剂， 所述FluA/H579反应试剂包含甲型流感病毒及 H5、 H7、 H9分型特异性引物、 甲型流感病毒及H5、 H7、 H9探针、 缓冲液、 酶混合液和冻干保护 剂， 所述甲型流感病毒及H5、 H7、 H9分型特异性引物包括上游引物和下游引物， 甲型流感病 毒上游引物序列如SEQID  NO:1所示， 甲型流感病毒下游引物序列如SEQID  NO:2所示， 甲型 流感探针序列如SEQID  NO:3所示； H5分型上游引物序列如SEQID  NO:4所示， H5分型下游引 物序列如SEQ ID NO:5所示， H5探针序列如SEQID  NO:6所示； H7分型上游引物序列如SEQID  NO:7所示， H7分型下游 引物序列如SEQID  NO:8所示， H 7探针序列如SEQID  NO:9所示； H9分型上游引物序列如SEQID   NO:10所示， H9分型下游引物序列如SEQID  NO:11所示， H9探针序列如SEQID  NO:12所示， 甲 型流感病毒及H5、 H7、 H9探针  5'端包括  FAM、 HEX、 ROX或CY5  的荧光报告基团， 3'端包括   BHQ1或BHQ2的荧 光淬灭基团。 2.根据权利要求1所述的甲型流感病 毒及多分型的检测试剂 盒， 其特征在于， 所述检测 试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品， 所述阳性对照品包含甲型流感病毒质粒、 H5分型 质粒、 H7分型质粒、 H9分型质粒及冻干保护剂， 所述阴性对照品包含TE水， 所述阳性对照品 为冻干粉状试剂。 3.根据权利要求1所述的甲型流感病 毒及多分型的检测试剂 盒， 其特征在于， 甲型流感 病毒及H5、 H7、 H9分型上下游引物浓度均为600nmol/L， 甲型流感病毒及H5、 H7、 H9探针浓度 为150nmol/L。 4.根据权利要求1所述的甲型流感病 毒及多分型的检测试剂 盒， 其特征在于， 所述酶混 合液包含5UHs‑Taq酶和2.5U  M‑MLV酶。 5.根据权利要求1所述的甲型流感病 毒及多分型的检测试剂 盒， 其特征在于， 所述缓冲 液包含30mmol/L  pH为8.8的Tris， 120mmol/L  KCl和1%DMSO、 300 μmol/L  dNTPs和3.5mmol/L   MgCl2。 6.根据权利要求1或2所述的甲型流感病毒及多分型的检测试剂盒， 其特征在于， 所述 冻干保护剂为5% 甘油、 2.5%蔗糖和1% 甘氨酸的混合物。 7.一种利用权利要求1所述的甲型流感病毒及多分型的检测试剂盒的检测方法， 其特 征在于， 步骤如下： S1.对待测样本进行核酸 提取； S2.将甲型流感病毒及H5、 H7、 H9 分型特异性引物、 甲型流感病毒及H5、 H7、 H9探针、 缓冲 液、 酶混合液和冻干保护剂混合， ‑20℃预冻， 真空干燥， 2 ‑8℃避光保存； S3.以甲型流感病毒质粒、 H5分型质粒、 H7分型质粒、 H9分型质粒及冻干保护剂作为阳 性对照品， ‑20℃预冻， 真空干燥， 2 ‑8℃避光保存； 以TE水作为阴性对照品； S4. 分别使用甲型流感病毒及H 5、 H7、 H9分型引物及探针进行多重荧 光定量PCR检测； S5.通过收集的荧 光曲线和Ct值判定结果； 所述利用甲型流感病毒及多分型的检测试剂盒的检测方法不用于疾病诊断或治疗。 8.根据权利要求7所述的甲型流感病毒及多分型的检测试剂盒的检测方法， 其特征在 于， PCR扩增条件为： 50℃逆转录20min， 93℃预变性2min； 93℃变性10s， 55℃荧光收集35s， 循环40次。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114457198 B 2一种甲型流感病毒及多分型的检测试剂盒及检测方 法 技术领域 [0001]本申请属于生物信息检测技术领域， 更具体地说， 是涉及一种甲型流感病毒及多 分型的检测试剂盒及检测方法。 背景技术 [0002]经过改革开放30多年的持续发展， 鸡肉已成为我国第二大肉类生产和消费品， 肉 鸡产业已成为 我国农村经济的支柱产业。 然而， 禽流感疫情是肉鸡乃至禽类面临的最大威 胁。 2004年首例禽流感在我国大陆暴发以来， 我国禽类因禽流感的发病数和死亡数至少是 362736羽和3915 01羽。 [0003]禽流感是由Ａ型流感病毒引起的一种禽类的感染性疾病。 禽流感病毒根据表面血 凝素蛋白和神经氨 酸酶的不同， 可以分为不同亚型， 目前发现有18种HA亚型和11种NA 亚型。 按病原体的类型， 禽流感可分为高致病性、 低致病性和非致病性三大类。 非致病性和 低致病 性禽流感的致死率较低； 而高致病 性禽流感由A型的H5、 H7及H9亚型流感病毒引起， 占我国 发生禽流感次数的90%以上。 [0004]现阶段对禽流感的检测， 主要通过临床症状、 分离培养、 免疫检测及PC R‑电泳法等 常规手段进行诊断及病原体排查。 分离培养耗时耗力， 需要严格的实验室环境、 通常需要3 天才能确诊； 而免疫检测 灵敏度低， 且存在 “窗口期”， 感染后3 ‑7天才能检测出相应的抗原 或抗体； 而PCR ‑电泳法则需要在PCR扩增结束后通过琼脂糖凝胶电泳的方法来进行结果判 断， 操作步骤繁琐， 检测灵敏度不高且容 易造成样本间的交叉污染以及实验环境污染。 发明内容 [0005]本发明就是为了解决上述背景技术的不足， 提供了一种甲型流感病毒及多分型的 检测试剂盒及检测方法。 本发 明的检测试剂盒联合多重荧光P CR检测方法， 能对禽类病料样 本及环境等样本中的病原体核酸进行检测， 判断其禽类是否感染甲型流感病毒， 且对高致 病性甲型流感中的H 5/H7/H9三个分型进行 快速准确区分。 [0006]为此， 本发明提供了一种甲型流感病毒及多分型的检测试剂盒， 包含FluA/H579反 应试剂， 所述FluA/H579反应试剂包含甲型流 感病毒及H5/H7/H9分型特异性引物、 甲型流 感 病毒及H5/H7/H9探针、 缓冲液、 酶混合液和冻干保护剂， 所述甲型流感病毒及H5、 H7、 H9分型 特异性引物包括上游引物和下游引物， 甲型流感病毒上游引物序列如SEQID  NO:1所示， 甲 型流感病毒下游引物序列如SEQID  NO:2所示， 甲型流感探针序列如SEQID  NO:3所示； H5分 型上游引物序列如SEQID  NO:4所示， H5分型下游引物序列如SEQID  NO:5所示， H5探针序列 如SEQID NO:6所示； H 7分型上游引物序列如SEQID  NO:7所示， H7分型下游引物序列如SEQID   NO:8所示， H7探针序列如SEQID  NO:9所示； H9分型上游引物序列如SEQID  NO:10所示， H9分 型下游引物序列如SEQ ID NO:11所示， H9探针序列如SEQ ID NO:12所示。 [0007]优选的， 甲型流感病毒及H5、 H7、 H9探针  5'端包括  FAM、 HEX、 ROX或CY5  的荧光报 告基团， 3'端包括  BHQ1或BHQ2  的荧光淬灭基团。说　明　书 1/9 页 3 CN 114457198 B 3