(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210364668.9 (22)申请日 2022.04.08 (71)申请人 广西宏廷智能科技有限公司 地址 530000 广西壮 族自治区南宁市邕武 路鸡村5队110-1号 （宋业房屋） (72)发明人 卜志锋　 (74)专利代理 机构 深圳腾文知识产权代理有限 公司 44680 专利代理师 李晓鹏 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一种利用RAA技术结合微流控技术检测沃柑 炭疽病的方法 (57)摘要 本申请实施例公开了一种利用RAA技术结合 微流控技术检测沃柑炭疽病的方法， 用于提高检 测效率。 本申请实施例方法包括： 提取炭疽病菌 叶的病株DNA基因组； 根据在GenBank的尖炭疽真 菌的ITS1和ITS4基因亚型的核 酸序列； 合成核 酸 序列得到合成序列， 通过对比合成序列的相对保 守区域确定序列对比信息； 根据序列对比信息确 定简并碱基； 通过简并碱基和RAA设计原则设计 合成序列的引物； 将引物与病株DNA基因组构成 反应体系后通过 RAA技术验证 反应体系是否得到 单一扩增条带； 若是， 则根据反应体系设置微流 控芯片的管路， 微流控芯片包括加样区。 将病株 DNA基因组加入所述微流控芯片的加样区后， 对 微流控芯片进行检测， 得到检测结果为阳性时， 则确定炭疽病菌叶的核酸序列。 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 CN 114703315 A 2022.07.05 CN 114703315 A 1.一种利用RA A技术结合微流控技术检测沃柑炭疽病的方法， 其特 征在于， 包括： S1、 提取炭疽病菌叶的病株DNA基因 组； S2、 根据在GenBan k的尖炭疽真菌的基因 组片段设计ITS1和ITS4基因亚型的核酸序列； S3、 合成步骤S2中的所述核酸序列得到合成序列， 通过对比所述合成序列的相对保守 区域确定序列对比信息； S4、 根据所述序列对比信息确定简并碱基； S5、 通过所述简并碱基和RAA设计原则设计所述合成序列的引物， 所述引物包括上游引 物、 下游引物以及探针； S6、 将所述引物与所述病株DNA基因组构成反应体系后通过RAA技术验证所述反应体系 是否得到单一扩增条 带； S7、 若得到单一扩增条带， 则根据所述反应体系设置微流控芯片的管路， 所述微流控芯 片包括加样区； S8、 将所述病株DNA基因组加入所述微流控芯片的加 样区后， 对所述微流控芯片进行检 测， 得到检测结果； S9、 当所述检测结果 为阳性， 则确定所述炭疽病菌叶的核酸序列。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤S1中将所述取炭疽病菌叶进行消毒后 放置于液氮预冷的研钵中研磨得到炭疽病菌叶粉末， 将所述炭疽病菌叶粉末置于1.5ml的 EP管中， 通过核酸 提取试剂盒进行DNA提取， 得到病株DNA组并放置 于‑20℃保存。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤S6中所述反应体系用RAA恒温扩增检 测仪进行检测。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述扩增产物通过1.2％的琼脂糖凝胶电 泳验证所述引物是否出现单一扩增条 带。 5.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所诉微流控芯片还包括反应区， 在步骤S7 之后所述方法还包括， 将完整反应预混液A和所述引物按荧光 RAA反应体系加入 所述微流控 芯片的所诉反应区中。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 在步骤S9之后所述方法还包括， 将所述病 株DNA组进行灵敏度检测， 所述灵敏度检测用于确定所述病株DNA组的浓度最低限值。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特 征在于， 按照预设浓度稀释所述病株DNA组的浓度。 8.根据权利 要求7所述的方法， 其特征在于， 将预设浓度稀释所得的病株DNA组进行RAA 等温扩增反应， 得到扩增产物； 所述扩增产物通过电泳所得的电泳条带确定所述浓度最低 限值。 9.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述预设浓度包括1 ×103copies/μL、 1 × 102copies/ μL、 1 ×101copies/ μL、 1 ×100copies/ μL、 1 ×10‑1copies/ μL。 10.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤S5中所述合成序列通过检测软件并 按照RAA设计原则进行对比分析后得到引物。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114703315 A 2一种利用RA A技术结合微流控技术检测沃柑炭 疽病的方 法 技术领域 [0001]本申请实施例涉及生物技术领域， 尤其涉及一种利用RAA技术结合微流控技术检 测沃柑炭疽病的方法。 背景技术 [0002]沃柑是坦普尔脐橙与丹西红桔的杂 交种,属于宽皮柑桔类型,是一个晚熟高糖品 种。 近年随着广西沃柑种植规模的扩大， 沃柑炭疽病爆发越来越多， 这种疾病在水果生长非 常快， 病原体很容易从腐烂的水果中分离出来。 分生孢子在果实上迅速萌发、 感染， 直到果 实成熟。 在成熟 过程中， 形成穿透 菌丝， 菌丝在下层组织中定植， 导 致炭疽病的发生。 [0003]炭疽病被认为是影响水果销路的主要因素。 这与当地的环境气候可能存在联系， 但有研究表明炭疽病原类型不同， 危害程度也不同。 该病危害范围广、 侵染时期长， 且具有 潜伏性， 不易防治。 发生严重时， 可造成大量落叶、 枯梢、 僵果、 落果， 导致树势衰弱， 产量大 幅下降。 炭疽病是由真菌引起的侵染性病害， 常发生在叶片、 枝梢、 花和果 实。 通常高温 高湿 的环境易 发病， 温度为主要， 以菌丝体和分生孢子在病梢、 病叶和病果上越冬。 第二年春季， 病组织上产生的分生孢子借风雨、 昆虫传播， 直接侵入或从气孔和伤口侵入。 炭疽菌是引起 炭疽病的病原菌， 不仅在沃柑上这种病菌发病率极高， 而且在其他柑橘， 甚至大多数植物， 从田间到货架均可存在， 具有危害时间长以及危害范围广等特点， 其造成的经济损失不容 忽视。 [0004]传统的分子鉴定技术与菌种的培养， 分离纯化及形态观察病原物鉴定等技术耗时 长， 且准确性低。 发明内容 [0005]本申请实施例提供了一种利用RAA技术结合微流控技术检测沃柑炭疽病的方法， 用于提高检测效率。 [0006]本申请实施例提供了一种利用RAA技术结合微流控技术检测沃柑炭疽病的方法， 包括： [0007]S1、 提取炭疽病菌叶的病株DNA基因 组； [0008]S2、 根据在GenBank的尖炭疽真菌的的基因组片段设计ITS1和ITS4基因亚型 的核 酸序列； [0009]S3、 合成步骤S2中的所述核酸序列得到合成序列， 通过对比所述合成序列的相对 保守区域确定序列对比信息； [0010]S4、 根据所述序列对比信息确定简并碱基； [0011]S5、 通过所述简并碱基和RAA设计原则设计所述合成序列的引物， 所述引物包括上 游引物、 下游引物以及探针； [0012]S6、 将所述引物与所述病株D NA基因组构成反应体系后通过RAA技术验证所述反应 体系是否得到单一扩增条 带；说　明　书 1/6 页 3 CN 114703315 A 3