(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210358563.2 (22)申请日 2022.04.06 (71)申请人 浙江大学 地址 310012 浙江省杭州市西湖区余杭塘 路866号 申请人 杭州馨海酶源生物科技有限公司 (72)发明人 于洪巍　李东炎　夏娜娜　 (74)专利代理 机构 杭州杭诚专利事务所有限公 司 33109 专利代理师 李博 (51)Int.Cl. C12N 9/04(2006.01) C12N 15/53(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/70(2006.01)C12N 1/21(2006.01) C12P 33/08(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 一种短链脱氢酶的突变体、 编码基因及编码 基因获得 方法、 突变 体的应用 (57)摘要 本发明属于生物工程技术领域， 具体涉及一 种短链脱氢酶的突变体， 所述突变体为突变体 L104A、 突变体A150Y、 突变体Y155A、 突变体 I158A、 突变体I202A或者突变体T2 05A； 所述短链 脱氢酶的氨基酸序列如SEQ  ID NO.1所示。 本发 明的短链脱氢酶突变体相对野生型短链脱氢酶 有更高的酶活性， 可以泼尼松或者配合水解酶以 醋酸泼尼松为底物制备泼尼松龙， 底物的转化率 高， 产物的收率高， 无副产物产生， 而且反应可在 更高的底 物浓度水平下进行， 适宜规模化 生产。 权利要求书2页 说明书9页 序列表13页 附图1页 CN 114875003 A 2022.08.09 CN 114875003 A 1.一种短链脱氢酶的突变 体， 其特征在于， 所述突变体为短链脱氢酶的第104 位的亮氨酸 突变为丙氨酸的突变 体L104A， 或者第15 0位的丙氨酸 突变为酪氨酸的突变 体A150Y， 或者第15 5位的酪氨酸 突变为丙氨酸的突变 体Y155A， 或者第158位的异亮氨酸 突变为丙氨酸的突变 体I158A， 或者第202位的异亮氨酸 突变为丙氨酸的突变 体I202A， 或者第20 5位的苏氨酸 突变为丙氨酸的突变 体T205A； 所述短链脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。 2.如权利要求1所述的突变 体的编码基因， 其特 征在于， 所述突变体L104A的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9； 所述突变体A150Y的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10； 所述突变体Y155A的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 1； 所述突变体I158A的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12； 所述突变体I202A的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13； 所述突变体T205A的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14。 3.一种获得如权利要求2所述的编码基因 的方法， 其特征在于， 所述突变体的编码基因 由短链脱氢酶的编码基因经 特异性引物对 扩增得到， 其中： 突变体L104A的编码基因对应的特异性引物对为 L104A_F/R， 核苷酸序列如下： L104A‑F tgctgtata atcgcgcgtc cttttttcatggcgaaat； L104A‑R aaaaggacgcgcgattatacagcacatgattcagaatcagc； 突变体A150Y的编码基因对应的特异性引物对为A15 0Y_F/R， 核苷酸序列如下： A150Y‑F gtagcgtgtatg gtaaaattacctatccgctgattg； A150Y‑R attttaccatacacgctactcac cacggcaata； 突变体Y155A的编码基因对应的特异性引物对为Y15 5A_F/R， 核苷酸序列如下： Y155A‑F tatccgctggcggccccgtatagcgcaa； Y155A‑R tacggggccgccagcggataggtaattttaccg； 突变体I158A的编码基因对应的特异性引物对为 I158A_F/R， 核苷酸序列如下： I158A‑F cattaaagccgcgagcggcatttatttaggtc； I158A‑R aatgccgctcgcg gctttaatggcggttt； 突变体I202A的编码基因的对应的特异性引物对为 I202A_F/R， 核苷酸序列如下： I202A‑F aaaccgccgcgaaagccaccagcggcatttattta； I202A‑R ggtggctttcgcggcggtttcggtatcaatca； 突变体T205A的编码基因的对应的特异性引物对为T20 5A_F/R， 核苷酸序列如下： T205Y‑F cattaaagcctatagcggcatttatttaggtccgg； T205Y‑R aaatgccgctataggctttaatggcggttt； 短链脱氢酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。 4.一种含有如权利要求2所述的编码基因 的重组表达载体， 其特征在于， 所述重组表达 载体为含有突变 体编码基因的质粒、 噬菌体或病毒载体。 5.根据权利要求4所述的重组表达载体， 其特征在于， 所述重组表达载体为含有突变体权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114875003 A 2编码基因的质粒pET ‑28a。 6.一种表达如权利要求1所述的突变体的工程菌， 特征在于， 工程菌通过如权利要求4 或5任一所述的重组表达载体转 化至宿主细菌中获得。 7.一种泼尼松龙的制备方法， 其特征在于， 包括以醋酸泼尼松为底物， 加入如权利要求 1所述的突变 体、 水解酶、 葡糖脱氢酶、 葡萄糖和含有机溶剂的pH缓冲溶 液反应； 或者， 包括以泼尼松为底物， 加入如权利要求1所述的突变体、 葡糖脱氢酶、 葡萄糖和含 有机溶剂的pH缓冲溶 液反应。 8.根据权利要求7所述的泼尼松龙的制备方法， 其特征在于， 所述突变体以如权利要求 6所述的工程菌发酵培养后的湿菌体形式加入， 或者以所得湿菌体破碎后的粗酶液 的形式 加入； 以湿菌体形式表示， 突变 体的加入量 为150～250g/L湿菌体。 9.根据权利要求7所述的泼尼松龙的制备方法， 其特征在于， 所述有机溶剂为异丙醇或 N,N‑二甲基甲酰胺； 有机溶剂在 pH缓冲溶 液中的体积分数为8～12 %。 10.根据权利要求7至9任一所述的制备 方法， 其特 征在于， 底物的添加浓度为20～80g/L； 葡萄糖脱氢酶的加入 浓度为15 0～250g/L; 葡萄糖的加入 浓度为20～40  g/L； 水解酶的添加浓度为15 0～250g/L； 所用pH缓冲溶 液为磷酸钾缓冲液， pH值 为6.0～7.0； 反应温度为3 0～48℃； 反应时间为16～3 0h； 振荡速率 为150～300rpm。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114875003 A 3