(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210351200.6 (22)申请日 2022.04.02 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114591945 A (43)申请公布日 2022.06.07 (73)专利权人 予果生物科技 （北京） 有限公司 地址 102600 北京市大兴区北京经济技 术 开发区地盛东路1号院6号楼5 01室 专利权人 西咸新区予果 微码生物科技有限 公司　 予果智造科技 （北京） 有限公司 (72)发明人 夏涵　官远林　付健　尚芳娟　 王鹏军　杨书恒　李长诚　佟斯垚　(74)专利代理 机构 西安鼎迈知识产权代理事务 所(普通合伙) 6126 3 专利代理师 李振瑞 (51)Int.Cl. C12N 15/10(2006.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) 审查员 张锦广 (54)发明名称 DNA病毒核酸提取检测试剂、 试剂盒及其方 法和应用 (57)摘要 本发明提供了一种DNA病毒核酸提取检测试 剂、 试剂盒及其方法和应用， 所述提取检测试剂 由InstaGen eMatrix、 Tris ‑HCl、 SDS、 KC l、 EDTA和 Sarkosyl组成， 本发明能够实现快速高效提取 EBV核酸， 将EB V的提取检测限提高到100拷贝数/ ml； 从复杂样本中亦能快速高效提取到EB V核酸， 验证了本提取方法潜在的临床适用性。 权利要求书1页 说明书9页 附图2页 CN 114591945 B 2022.12.06 CN 114591945 B 1.一种DNA病毒 核酸提取检测方法， 其特 征在于， 所述的提取检测方法包括如下步骤： (1)将含有病毒样本 离心沉淀， 参数为10 000‑14000rpm， 移除上清； (2)加入核酸提取检测试剂到步骤(1)得到的菌落沉淀物， 所述提取检测试剂由 InstaGene Matrix、 Tris ‑HCl、 SDS、 KCl、 EDTA和Sarkosyl组成， 所述InstaGene  Matrix的质 量浓度为1％ ‑15％； Tris ‑HCl物质的量浓度为10m  mol/L‑100mmol/L， pH为8.0； SDS的质量 浓度为1％ ‑20％； KCl物质的量浓度为10m  mol/L‑100m mol/L； EDTA物质的量浓度为1m   mol/L‑10mmol/L； Sarko syl的质量浓度为1 ％‑5％； 震荡混匀； 之后将混合物置于沸水浴中， 放置5‑10分钟， 之后室温冷却1 ‑3分钟； (3)将裂解产物高速 离心沉淀， 参数为10 000‑14000rpm； (4)取上清液， 用于后续的质量控制与目标基因检测； 所述提取检测方法还 包括： 所述引物设计与合成、 qPCR扩增、 qPCR检测与结果分析。 2.根据权利要求1所述的一种DNA病毒核酸提取检测方法， 其特征在于， 所述提取检测 方法还包括： 打断与建库、 上机测序、 数据分析。 3.根据权利要求1所述的一种DNA病毒核酸提取检测方法， 其特征在于， 所述提取检测 试剂制备好后高压灭菌并置 于4℃长期保存以备使用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114591945 B 2DNA病毒核酸提取检测试剂、 试剂盒及其方 法和应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物技 术领域， 具体涉及DNA病毒 核酸的提取与检测技 术领域。 背景技术 [0002]EB病毒(Epstein ‑Barrvirus， EBV)是疱疹病毒科嗜淋巴细胞病毒属的成员， 基因 组为DNA。 EBV具有在体内外专一性地感染人类及某些灵长类B细胞的生物学特性。 人是EBV 感染的宿主， 主要通过唾液传播， 无症状感染多发生在幼儿， 3 ‑5岁幼儿90％以上曾感染 EBV， 90％以上的成人都有病毒抗体。 EBV是传染性单核细胞增生症的病原体， 还与鼻咽癌、 儿童淋巴瘤的发生有密切相关性， 被列为可能致癌的人类肿瘤病毒之一。 [0003]为了对EBV进行科学 防控与诊 断， 需要对此类DNA病毒进行核酸提取优化， 以便于 后期进行深入研究， 例如分子诊断等。 当前 的病毒提取方法所依赖的商用试剂盒不仅提取 速度慢， 工作效率偏低， 而且后 期难以对残留病毒进 行清理。 例如一般病毒核酸的提取会利 用胍盐进行裂解， 胍盐能溶解蛋白质并且导致病毒颗粒破碎， 使得核蛋白由于其二级结构 的破坏而快速与核酸分离。 然而胍盐在实际裂解过程中所需裂解时间较长， 且裂解液与结 合液加入时间不同， 同时需添加蛋白酶K进行协助裂解， 导致病毒核酸提取时间过长， 提取 效率较低。 此外， 病毒核酸提取还可以采用超声处理、 珠击、 酶、 混合(涡旋)、 机械剪切和 离 液溶液等步骤， 但是这些步骤并不能直接实现提取目的， 经过上述处理后还需要实际提取 程序提取， 最终为整个提取 过程添加了复杂性和操作时间。 发明内容 [0004]针对上述内容中所记载的技术问题中的一种， 本发明提出了一种DNA病毒核酸提 取检测试剂、 试剂盒及其方法和应用， 通过该方法， 不仅可以减少样本间的交叉污染， 还可 以有效灭活传染性病毒， 并且大大缩短了整个病毒核酸提取 的周期， 而且还能够将提取限 提高至100拷贝/ml。 相较于传统提取方法， 该方法提取DNA病毒核酸的效率提高了至少10倍 以上， 大大节约了成本， 提高了提取效率， 解决了现有DNA病毒提取低效、 成本较高的实际问 题。 [0005]第一方面， 本发明提供了一种DNA病毒核酸提取检测试剂， 所述提取检测试剂由 InstaGene Matrix、 Tris ‑HCl、 SDS、 KCl、 EDTA和Sark osyl组成。 [0006]进一步的， 本发明所述取检测试剂中InstaGene  Matrix的质量浓度为1％ ‑15％； Tris‑HCl物质的量浓度为10m  mol/L‑100m mol/L， pH为8.0； SDS的质量浓度为1％ ‑20％； KCl物质的量浓度为10mmol/L ‑100m mol/L； EDTA物质的量浓度为1m  mol/L‑10m mol/L； Sarkosyl的质量浓度为1％ ‑5％。 [0007]本发明中， 所述提取检测试剂为缓冲溶液； 所述缓冲溶液制 备好后高压灭菌并置 于4℃长期保存以备后用。 [0008]第二方面， 本发明提供了一种D NA病毒核酸提取检测方法， 所述的提取检测方法包 括如下步骤：说　明　书 1/9 页 3 CN 114591945 B 3