(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211019720.3 (22)申请日 2022.08.24 (71)申请人 中国烟草总公司郑州烟草研究院 地址 450001 河南省郑州市高新区枫杨街2 号 (72)发明人 刘萍萍　翟妞　陈千思　郑庆霞　 张慧　徐国云　金立锋　王晨　 周会娜　 (74)专利代理 机构 郑州联科专利事务所(普通 合伙) 41104 专利代理师 张晓萍 (51)Int.Cl. G01N 30/88(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 1/28(2006.01) (54)发明名称 一种烟草原生质体蛋白质组的提取和检测 方法 (57)摘要 本申请属于植物 生理学技术领域， 具体涉及 一种烟草原生质体中蛋白质组的提取和检测方 法。 该方法以烟草原生质体为提取对象， 具体包 括： 制备烟草原生质体、 细胞裂解、 获得全蛋白、 检测等步骤。 本申请中， 基于烟草蛋白质组研究 需要， 发明人对烟草蛋白质组提取方法和检测方 法进行了优化， 并结合相关非生物因素胁迫处 理， 对烟草蛋白质成分变化情况进行了初步研 究。 结果表明， 本申请所提供的提取方法和检测 方法， 灵敏度较高， 可有效支撑代谢蛋白质组研 究应用， 从而可为相关分子调节通路研究、 基因 功能研究奠定良好的技术基础， 表现出较好的实 用价值。 权利要求书2页 说明书6页 附图3页 CN 115327016 A 2022.11.11 CN 115327016 A 1.一种烟草原生质体中蛋白质组的提取和检测方法， 其特征在于， 该方法以烟草原生 质体为提取对象， 具体包括如下步骤： （一） 备料 按照现有技 术， 以烟草叶肉细胞为原料， 制备烟草原生质体备用； （二） 细胞裂解 将原生质体样品溶于十二烷基硫酸钠缓冲液中， 超声破碎； 破碎后， 加入预冷的丙酮， 在‑20℃条件下沉淀4小时以上； （三） 获得全蛋白 将步骤 （二） 中沉淀处理后混合液进行离心， 弃上清， 并用预冷丙酮清洗后， 用重悬液进 行重悬， 再次超声处 理后， 离心收集获得全蛋白； （四） 检测 取步骤 （三） 中所提取全蛋白样品， 烷基化处理后， 胰蛋白酶消化酶解， 并利用HLB固相 萃取柱对消化酶解后肽段进行提纯； 检测时， 根据数据采集方式不同可分为： 数据依赖采集DDA方法和数据非依赖采集DIA 方法； 具体而言： 数据依赖采集(  DDA)方法： 流动相A： 0.1%甲酸 ‑  MS水； 流动相B： 0.1%甲酸 ‑  MS CAN； 线性梯度： 分析过程中， 选择响应值 最大的30‑50个离子进行二级采集； TOF‑MS的质量范围为3 50 ~ 1250 m/z， 高分辨 率模式(> 2.5万)， 采集时间为25 0 ms； 加热后毛细管的喷雾电压设置为2.5  kV， 温度设置为15 0℃； 数据非依赖采集(  DIA)方法： LC参数条件与上述条件相同； 构建了80个动态窗口， 质量范围3 50 ~ 1500 Da， 离子积累时间为20 ‑50 ms。 2.如权利要求1所述烟草原生质体中蛋白质 组的提取和检测方法， 其特征在于， 步骤 （一） 中， 所述烟草原生质体为Cd处 理后原生质体。 3.如权利要求1所述烟草原生质体中蛋白质 组的提取和检测方法， 其特征在于， 步骤 （二） 中， 所述超声破碎为： 6 0%的功率超声3 0‑60秒进行破碎。 4.如权利要求1所述烟草原生质体中蛋白质 组的提取和检测方法， 其特征在于， 步骤 （三） 中， 所述重悬 液： 重悬液中含有6 ‑8 M尿素和50 mM碳酸氢铵； 具体操作为： 将步骤 （二） 中沉淀处 理后混合液在4℃条件下， 13 000‑20000 g离心5‑20分钟， 留沉淀；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115327016 A 2用1毫升预冷丙酮对沉淀进行重悬清洗后， 4℃、 13 000‑20000 g离心5‑20分钟； 留沉淀； 将沉淀物用1 ‑3 mL重悬液进行重悬， 并进行超声处 理； 超声处理结束后， 4℃、 13 000‑20000 g离心5‑20分钟， 收集所 得即为全蛋白。 5.如权利要求1所述烟草原生质体中蛋白质组 的提取和检测方法， 其特征在于， 检测前 对所提取全蛋白的具体处 理操作为： （1） 将全蛋白与终浓度5  mM的二硫苏糖醇  DTT混合均匀后， 56℃条件下孵育30  min； 然 后用40 mM碘乙酰胺 IAA 在黑暗条件下将蛋白质烷基化处理30  min； 再后补加DTT至终浓度 10 mM， 并继续 黑暗条件下处 理10min； （2） 将上述蛋白质烷基化后样品用50  mM碳酸氢铵稀释后， 加入胰蛋白酶， 摇床上37 °C 酶解消化处 理12‑24小时； 以质量比计， 蛋白： 胰蛋白酶=25 ‑50:1； （3） 对步骤 （2） 中消化后样品， 利用HLB固相萃取柱  (SPE)进行脱盐处理， 并用1%三氟乙 酸TFA对所 得多肽样品进行洗涤； 最后， 用1 ‑3 mL 80% 乙腈 ACN 和0.1% TFA从HLB固相萃取柱S PE洗脱样品， 干燥。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115327016 A 3