(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211396885.2 (22)申请日 2022.11.09 (71)申请人 杭州百凌生物科技有限公司 地址 310052 浙江省杭州市滨江区滨安路 688号天和高科技产业园5号楼13 03室 (72)发明人 胡旻　李明振　潘丽　蔡宁　 (74)专利代理 机构 杭州信与义专利代理有限公 司 33450 专利代理师 万景旺 (51)Int.Cl. C12N 5/09(2010.01) C12N 5/071(2010.01) C12N 5/0783(2010.01) A01K 67/027(2006.01) G01N 1/28(2006.01)G01N 1/30(2006.01) G01N 21/84(2006.01) (54)发明名称 一种移植瘤组织的制备方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种移植瘤组织的制备方法 和应用， 属于生物技术领域。 还公开了用于制备 移植瘤组织的试剂组合， 包括PMA和白介素， 其 中， 所述白介素包括白介素2、 白介素10和白介素 12。 利用本发明的试剂组合、 试剂盒及方法制备 移植瘤组织， 进一步制备质控品， 不需要复杂操 作， 也不需要大量耗材、 培养设备和培养空间， 十 分方便进行规模化生产； 本发明的移植瘤组织不 但来源和性状稳定， 而且移植瘤拥有类组织形 态， 制备成为质控品在病理判读方面可以提供更 多的信息， 不仅可用于监控免疫组化实验过程， 还可以辅助判读病理结果， 具有十分重要的临床 应用价值。 权利要求书1页 说明书14页 附图3页 CN 115537401 A 2022.12.30 CN 115537401 A 1.一种用于制备移植瘤组织的试剂组合， 其特征在于， 包括PMA和白介素， 其中， 所述白 介素包括白介素2、 白介素10和白介素12。 2.根据权利 要求1所述的试剂组合， 其特征在于， 所述白介素2、 白介素10和白介素12的 比例为1:1:1。 3.一种制备移植瘤组织的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1， 将用于成瘤的细胞在对应的完全培 养基中进行培 养， 传代2～3次； S2， 在所述完全培养基中加入PMA、 白介素2、 白介素10和白介素12后， 重悬细胞得到细 胞悬液， 恢复培 养1～3h， 将细胞 悬液注射裸鼠腋下； S3， 正常饲养裸鼠并观察成瘤情况， 切下皮下肿 块并修整去除多余结缔组织后获取得 到的即为移植瘤组织。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 步骤S2和S3之间， 进一步包括对细胞进行 同步化处理的步骤： 将细胞转移至不含胎牛血清及其替代物的基础培养基中进行饥饿处理 16～24h， 然后将细胞转移至 完全培养基中进行培 养， 收集处于分裂期的细胞。 5.根据权利要求3或4所述的方法， 其特征在于， 步骤S2中， PMA的终浓度为50～500ng/ mL； 白介素2、 白介素10和白介素12的终浓度分别为5 0～100ng/mL。 6.根据权利要求3或4所述的方法， 其特征在于， 步骤S3后， 进一步包括将获得的移植瘤 组织切块洗净移植至另一只裸鼠身上的步骤， 再次饲养并获取移植瘤组织， 重复至少一次。 7.权利要求1所述的试剂组合在制备移植瘤组织中的用途。 8.根据权利要求7所述的用途， 其特征在于， 所述试剂组合基于权利要求3 ‑6任一所述 的方法制备 所述移植瘤组织。 9.利用权利要求3 ‑6任一所述的方法制备 得到的移植瘤组织。 10.权利要求9所述的移植瘤组织在制备用于免疫组织 化学检测的质控品中的用途。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115537401 A 2一种移植瘤组织的制备方 法和应用 技术领域 [0001]本发明属于生物技 术领域， 具体地， 涉及一种移植瘤组织的制备 方法及其应用。 背景技术 [0002]由基因融合突变引起的肿瘤突变率低， 质控材料获取的难度相当大， 以间变性淋 巴瘤激酶(ALK)融合基因为例， 该融合基因突变在非小细胞肺癌中的突变率大约在4％左 右， 常见的融合形式是ALK ‑EML4。 针对AKL融合突变阳性的非小细胞肺癌靶向药治疗 可以有 效地抵抗耐药性而延长患者的生存期， 最重要的靶向治疗指标之一。 但由于较低的融合突 变率， 阳性病理样本并不容易 获得， 且不同批次的阳性组织间性状非常不稳定， 很难作为一 个可供长期使用的稳定的质控品。 细胞系质控品材料的培养则需要消耗大量培养基、 血清、 培养容器、 培养箱空间， 成本高， 获取周期 长， 产量低， 整个细胞生长周期内都需要技术人员 进行扩大、 维护操作(通常2～3周收获一批， 批产量约200M细胞， 可形成5mm3左右细胞团)， 细胞类型单一， 无形态学特征， 在病理判读方面价值不高。 各类融合基因突变类型的肿瘤病 理检测质控品都面临的类似的问题。 发明内容 [0003]为了解决上述技术问题中的至少一个， 本 发明通过从ALK ‑EML4融合基因突变的非 小细胞肺癌中分离并建立的阳性细胞株NCI ‑H2228以及ALK基因不相关的T淋巴细胞瘤阴性 细胞株Jurkat培养经过诱导处理后注射裸鼠并在体内形成瘤体。 收获鉴定后， 将瘤体切割 成小块重新埋入裸鼠体内成瘤， 并通过这样的二次移植操作获取生长速度更快， 性状更稳 定的移植瘤。 该移植瘤在瘤细胞胞浆内的生物标记物蛋白表达， 与病理组织样本中待检的 ALK‑EML4融合基因突变标记物具有高度相似性， 且表达丰度稳定， 从而完成本发明。 具体 地， 本发明的技 术方案如下： [0004]本发明第一方面提供一种用于制备移植瘤组织的试剂组合， 包括PMA和白介素， 其 中， 所述白介素包括白介素2、 白介素10和白介素12。 [0005]PMA也称TPA， 全称为Phorbol ‑12‑myristate ‑13‑acetate(PMA)， 或12 ‑O‑ Tetradecanoylphorbol  13‑acetate(TPA)， 是一种最 常用的佛波酯(phorbol  ester)， 可以 用于刺激体外 淋巴细胞增值和细胞因子表达。 白细胞介素， 简称白介素， 是指在白细胞或免 疫细胞间相互作用的淋巴因子， 是一种细胞因子。 在本发 明中， 发明人意外地 发现， 将P MA和 三种白介素复配能够显著促进成瘤， 是本领域 技术人员无法预 料的。 [0006]在本发明的一些优选 实施方案中， 所述白介素2、 白介素10和白介素12的混合比例 为1:1:1。 [0007]本发明第二方面 提供一种制备移植瘤组织的方法， 包括以下步骤： [0008]S1， 将用于成瘤的细胞在对应的完全培养基中进行培养， 传代2～3次， 每次传代时 细胞密度控制在80％ ‑90％之间， 传代比率控制在1:3， 根据细胞状态大约每隔3天进行1次 传代或更 换培养基；说　明　书 1/14 页 3 CN 115537401 A 3