(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211035980.X (22)申请日 2022.08.27 (71)申请人 吉林省农业科 学院 地址 130033 吉林省长 春市净月高新 开发 区生态大街13 63号 (72)发明人 陈亮　王跃强　邱红梅　陈健　 侯云龙　刘德泉　崔正果　王新风　 胡金海　马晓萍　 (74)专利代理 机构 西安铭泽知识产权代理事务 所(普通合伙) 61223 专利代理师 崔瑞迎 (51)Int.Cl. G01N 21/64(2006.01) G01N 1/28(2006.01) G01N 1/38(2006.01) (54)发明名称 一种连续测定胰蛋白酶抑制剂活性的方法 及应用 (57)摘要 本发明属于抗营养因子活性检测技术领域， 具体为一种连续测定胰蛋白酶抑制剂活性的方 法， 包括以下步骤： (1)制作空白对照， (2)制作待 测样品， (3)以反应持续时间为横坐标、 410nm处 的吸光度值为纵坐标， 分别绘制空白对照和待测 样品的反应进程曲线， 并分别获得空白对照和待 测样品的曲线斜率m， 即m空白对照和m样品为二者的反 应速率， (4)计算胰蛋白酶抑制剂活性， 具体公式 为： TIU＝44.64 ×(m空 白对照‑m样 品)， 结果以每毫克大 豆粉中的胰蛋白酶抑制剂单位(U/mg)表示， 其中 44.64为换算系数。 本发明能在线性反应期测定 反应速度， 并计算出准确的胰蛋白酶抑制剂活 性。 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 CN 115290622 A 2022.11.04 CN 115290622 A 1.一种连续测定胰蛋白酶抑制剂活性的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)制作空白对照： 在胰蛋白酶反应体系中加入胰蛋白酶作用底物， 混匀后， 立即测定 410nm处的吸光度， 持续90s –150s， 并以3s ‑5s的时间 间隔记录吸光度值； (2)制作待测样品： 在胰蛋白酶反应体系中加入待测的胰蛋白酶抑制剂和胰蛋白酶作 用底物， 混匀后， 测定410nm处的吸光度， 持续1min30s ‑2min30s， 并以3s ‑5s的时间间隔记录 吸光度值； (3)以反应持续时间为横坐标、 410nm处的吸光度值为纵坐标， 分别绘制空白对照和待 测样品的反应进程曲线， 并分别获得空白对照和待测样品的曲线斜率m， 即m空 白对照和m样 品为二 者的反应速率； (4)计算胰蛋白酶抑制剂活性， 具体公式为： TIU＝44.64 ×(m空 白对照‑m样 品)， 结果以每毫克 大豆粉中的胰蛋白酶抑制剂单位U/mg表示， 其中4 4.64为换算系数； 所述胰蛋白酶反应 体系由Tris缓冲液和胰蛋白酶溶 液组成。 2.根据权利要求1所述的一种连续测定胰蛋白酶抑制 剂活性的方法， 其特征在于， 所述 Tris缓冲液与所述胰蛋 白酶溶液的体积比为4 ‑6： 1， 所述Tris缓冲液的浓度为0.05mol/L， 所述胰蛋白酶溶 液的浓度为0.1mg/mL。 3.根据权利要求1所述的一种连续测定胰蛋白酶抑制 剂活性的方法， 其特征在于， 所述 胰蛋白酶作用底 物为N‑苯甲酰‑DL‑精氨酸对硝基苯酰胺盐酸盐溶 液。 4.根据权利要求3所述的一种连续测定胰蛋白酶抑制剂活性的方法， 其特征在于， (1) 所述胰蛋白酶作用底 物与所述胰蛋白酶反应 体系的体积比为1 ‑2： 1。 5.根据权利要求1所述的一种连续测定胰蛋白酶抑制剂活性的方法， 其特征在于， (2) 中， 所述胰蛋白酶抑制剂为胰蛋白酶抑制剂提取物， 所述待测的胰蛋白酶抑制剂提取物： 所 述胰蛋白酶作用底 物的体积比为1： 4 ‑5， 所述胰蛋白酶作用底 物的浓度为 43.47mg/mL。 6.根据权利要求5所述的一种连续测定胰蛋白酶抑制 剂活性的方法， 其特征在于， 所述 待测的胰蛋白酶抑制剂提取物的获得方法为： 将含有胰蛋白酶抑制剂的样品与NaOH溶液混 合获得悬浮液， 将悬浮液在室温下搅拌后离心， 所得上清液即为待测的胰蛋白酶抑制剂提 取液。 7.根据权利要求6所述的一种连续测定胰蛋白酶抑制 剂活性的方法， 其特征在于， 所述 NaOH溶液的浓度为0.01mol/L， 所述含有胰蛋 白酶抑制剂的样品的量与所述NaOH溶液的体 积比为1g： 40 ‑60mL。 8.根据权利要求1所述的一种连续测定胰蛋白酶抑制 剂活性的方法， 其特征在于， 所述 Tris缓冲液的pH＝8.20 。 9.权利要求1所述的一种连续测定胰蛋白酶抑制剂活性的方法用于测定大豆制品中的 胰蛋白酶抑制剂活性。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115290622 A 2一种连续测定胰蛋白酶抑制剂活性的方 法及应用 技术领域 [0001]本发明涉及 抗营养因子活性检测技术领域， 具体涉及一种连续测定胰蛋白酶抑制 剂活性的方法。 背景技术 [0002]大豆是重要的粮油兼用作物， 同时也是人类优质蛋白及畜牧业饲料蛋白的主要来 源。 然而， 大豆含有一些与植物自身保护和免疫机制相关的抗营养因子会阻止大豆蛋白质 的利用和消化， 其中的胰蛋白酶抑制剂更是导致家畜生长迟缓和消化代谢疾病的最主要成 分。 因此， 胰蛋白酶抑制剂活性的测定对于评价大豆粉加工后的营养价值、 提供优质饲料产 品具有重要意 义。 [0003]目前， 测定大豆制品中胰蛋白酶抑制剂活性的标准方法属于固定时间监测法， 需 要保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要很精确， 否则将引起较大误差； 每次测定还 需要准备几个试验稀释液， 试图达到样品抑制率在总胰蛋白酶活性的40％到60％之间的浓 度， 以便将相对标准偏差降至最低。 此外， 由于需要停止反应后才能够测定底物的变化， 因 此很难进行连续监测， 且无法根据整个酶反应曲线情况避开延滞期和非线性反应期， 这就 导致现行标准方法的准确度和灵敏度均不 甚理想。 [0004]综上， 急需开发一种连续测定胰蛋白酶抑制剂活性的方法改进的连续监测方法， 以克服现行 大豆胰蛋白酶抑制剂活性测定标准方法的缺 点。 发明内容 [0005]为解决上述技术问题， 本发明提供了一种连续测定胰蛋白酶抑制剂活性的方法， 降低随机误差、 提高灵敏度、 扩展测定数据值的线性覆盖范围、 缩短反应时间、 减少检测成 本。 [0006]一种连续测定胰蛋白酶抑制剂活性的方法， 包括以下步骤： [0007](1)制作空白对照： 在胰蛋白酶反应体系中加入胰蛋白酶作用底物， 混匀后， 立即 测定410nm处的吸光度， 持续90s ‑150s， 并以3s ‑5s的时间 间隔记录吸光度值； [0008](2)制作待测样品： 在胰蛋白酶反应体系中加入待测的胰蛋白酶抑制剂和胰蛋白 酶作用底物， 混匀后， 测定410nm处的吸光度， 持续1min30s ‑2min30s， 并以3s ‑5s的时间间隔 记录吸光度值； [0009](3)以反应持续时间为横坐标、 410nm处的吸光度值为纵坐标， 分别绘制空白对照 和待测样品的反应进程曲线， 并分别获得空白对照和待测样品的曲线斜率m， 即m空 白对照和m样 品 为二者的反应速率； [0010](4)计算胰蛋白酶抑制剂活性， 具体公式为： TIU＝44.64 ×(m空 白对照‑m样 品)， 结果以每 毫克大豆粉中的胰蛋白酶抑制剂单位U/mg表示， 其中4 4.64为换算系数； [0011]所述胰蛋白酶反应 体系由Tris缓冲液和胰蛋白酶溶 液组成。 [0012]优选的， 所述Tris缓冲液与所述胰蛋白酶溶液的体积比为4 ‑6： 1， 所述Tris缓冲液说　明　书 1/6 页 3 CN 115290622 A 3