(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211119800.6 (22)申请日 2022.09.15 (71)申请人 江苏省人民医院 （南京医科 大学第 一附属医院） 地址 210029 江苏省南京市广州路3 00号 (72)发明人 李欣彤　于涵洋　管晓翔　张泽　 魏东瀛　 (74)专利代理 机构 南京鑫之航知识产权代理事 务所(特殊普通 合伙) 32410 专利代理师 姚兰兰 (51)Int.Cl. A61K 47/54(2017.01) A61K 31/4439(2006.01) A61K 31/713(2006.01) A61K 31/519(2006.01)A61P 35/00(2006.01) C12N 15/115(2010.01) (54)发明名称 一种基于非天然核酸适体的PROTAC的制备 方法及其在三阴性乳腺癌治 疗中的应用 (57)摘要 本发明属于非天然核酸筛选和乳腺癌靶向 治疗领域， 尤其涉及一种基于非天然核酸适体的 PROTAC （PROteolysis ‑TArgeting  Chimera） 的制 备方法及其在三阴性乳 腺癌治疗中的应用。 本发 明首先利用体外筛选技术鉴定出能够结合c ‑ Myc/Max二聚体的苏糖核 酸(TNA)适体， 连接天然 结合c‑Myc的E box DNA序列， 形成二价亲和分 子， 进一步连接泛素连接酶E3的配体， 构建T NA适 体‑E box‑E3配体复合物 （TEP） ， 该复合物特异性 诱导c‑Myc降解。 当与palbociclib联用时， TEP高 效抑制了三阴性乳腺癌小鼠中肿瘤的生长。 与现 有的小分子抑制剂比较， 本发明中的基于非天然 核酸的PROTA C分子亲和性更高， 在使用剂量更小 的情况下， 仍具有高效的抗肿瘤效果。 TNA的引入 增强了复合物的亲和力、 生物稳定性和靶向性， 更适用于体内应用， 为T NBC的靶向治疗提供了新 的策略。 权利要求书1页 说明书6页 附图11页 CN 115475252 A 2022.12.16 CN 115475252 A 1.一种基于非天然核酸适体的PROTAC复合物分子， 其特征在于： 包括结合c ‑Myc/Max二 聚体的非天然核酸适体、 天然结合c ‑Myc/Max的E  box DNA 序列、 以及一个招募E3泛素连接 酶的小分子配 体。 2.根据权利 要求1所述的一种基于非天然核酸适体的PROTAC复合物， 其特征在于： 所述 的非天然核酸为苏糖核酸TNA。 3.根据权利 要求1所述的一种基于非天然核酸适体的PROTAC复合物， 其特征在于： 所述 E3泛素连接酶配 体为泊马 度胺Pomal idominde。 4.根据权利要求1 ‑3任意一项所述的一种基于非天然核酸适体的PROTAC的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 体外筛选非天然核酸适体； 对富集文库进行高通量测序， 挑选 拷贝数高的序列进行亲和性测试； 连接非天然核酸适体、 E  box DNA和E3泛素连接酶配体， 即制得靶向降解c ‑Myc的、 基于非 天然核酸的PROTAC 。 5.根据权利 要求4所述的一种基于非天然核酸适体的PROTAC的制备方法， 其特征在于， 体外筛选非天然核酸适体包括以下步骤： 1)以生物素标记的DNA随机文库为模板， 体外 “转录”合成非天然核酸文库， 通过链霉亲 和素树脂分离， 乙醇沉淀法收集非 天然核酸文库； 2)体外构建c ‑Myc/Max二聚体， 与非天然核酸文库孵育， 非天然核酸文库与c ‑Myc/Max 的摩尔比为第一轮1:1， 第二轮2:1， 第三轮10:1， 通过毛细管电泳进行分离， 毛细管进样体 积为11 nL， 回收与c ‑Myc/Max结合的非 天然核酸组分； 3)以回收到的组分为模板， 使用非天然核酸聚合酶将非天然核酸 “逆转录”为DNA序列， 用于下一轮筛 选。 6.根据权利 要求4所述的一种基于非天然核酸适体的PROTAC的制备方法， 其特征在于， 亲和性测试包括以下步骤： 1)利用带有E  box增强子序列的引物， 以DNA序列为模板， 在非天然核酸聚合酶催化下， “转录”合成带有E  box序列的非 天然核酸序列； 2)通过链霉亲和素柱分离非 天然核酸‑E box链； 3)将带有E  box序列的DNA作为互补链， 与非天然核酸 ‑E box链进行退火， 形成杂交双 链； 4)将上述 的杂交双链与c ‑Myc/Max二聚体孵育30  min， 利用8%的非变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳分析混合物， 在80  V恒压及冰浴条件下， 电泳1  h， 分析亲和性强弱。 7.根据权利 要求4所述的一种基于非天然核酸适体的PROTAC的制备方法， 其特征在于： 将E3泛素连接酶配体连接到非天然核酸适体的E  box的末端的具体方法为： 利用酰胺化反 应将E3泛素连接酶配体连接到非天然核酸适体的E  Box的末端， 形成非天然核酸 ‑E box‑E3 泛素连接酶配 体分子。 8.根据权利要求1 ‑7任意一项所述的一种基于非天然核酸适体的PROTAC的应用， 其特 征在于： 所述非 天然核酸PROTAC应用于抑制三阴性乳腺癌增殖。 9.根据权利 要求8所述的一种基于非天然核酸适体的PROTAC的应用， 其特征在于： 利用 阳离子脂质体纳米粒子包裹CDK4/ 6抑制剂或TEP， 进行 药物联用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115475252 A 2一种基于非天然核酸适体的P ROTAC的制备方 法及其在三阴性 乳腺癌治疗中的应用 技术领域 [0001]本发明属于非天然核酸筛选和乳腺癌靶向治疗领域， 尤其涉及 一种基于非天然核 酸适体的PROTAC的制备 方法及其在三阴性乳腺癌治疗中的应用。 背景技术 [0002]乳腺癌是发病率第一， 死亡率第二的恶性肿瘤。 其中， 三阴性乳腺癌(Triple ‑ negative  breast cancer,TNBC)的侵袭性强、 复发率高、 临床预后差。 因缺少可利用的有效 靶点， 治疗药物的选择十 分有限。 许多在其他乳腺癌亚型中具有较好疗效的靶向药物分子， 在TNBC的治疗中响应率较低。 [0003]近年来， 越来越多的研究表明， c ‑Myc是TNBC潜在的治疗靶点。 c ‑Myc是一类癌基 因， 在超过50％的人类癌症中高表达。 c ‑Myc与其相关因子X(Max)共同作用结合DNA增强子 原件结合DNA增强子原件(E  box， 5’ ‑CAC[G/A]TG ‑3’)， 调节下游参与细胞的增殖、 分化、 凋 亡以及血管生成的靶基因的转录。 在TNBC中， c ‑Myc的高表达与TNBC预后差相关， 因此， 靶向 抑制c‑Myc可能为TNBC提供一种潜在的治疗策略。 [0004]目前报道的靶向c ‑Myc抑制剂主要为小分子抑制剂， 其作用机制是阻断c ‑Myc与 Max的相互作用， 从而阻断转录功能。 然而， c ‑Myc是一类天然的无序蛋白， 缺乏小分子可以 利用的识别位点， 寻找直接作用于c ‑Myc的小分子抑制剂是国际上药物研发的难点， 目前已 经报道的c ‑Myc的小分子抑制剂活性普遍较低， 特异 性差， 毒性高， 进入临床 应用较为困难。 核酸适体是一类具有靶向功能的生物大分子， 可以利用的结合位点更多， 经过化学修饰的 非天然核酸具备区别于天然核酸的化学结构， 可以增强核酸分子的生物稳定性， 是新型 的 可以用于疾病的诊断和治疗的分子 工具。 [0005]核酸适体与靶标结合通常是一一对应的关系， 为了实现适体在体内与靶标形成多 次转换对应的关系， 可以借鉴蛋白降解靶向嵌合体(PROteolysis  TArgeting  Chimera, PROTAC)， 在适体的序列末端通过化学手段连接一个泛 素连接酶的配体， 在细胞内招募泛 素 连接酶， 对临近的蛋白进行泛素化标记， 从而诱导蛋白质降解。 在这个过程中， 由于核酸适 体‑泛素连接酶配体复合物不会被降解， 所以一个核酸适体 ‑泛素连接酶配体复合物可以诱 导多个蛋白的降解。 [0006]综上所述， 利用体外筛选技术分离可以靶向c ‑Myc/Max二聚体的TNA适体， 并在筛 选文库中引入E  box DNA序列， 竞争性抑制c ‑Myc/Max复合物与靶基因的结合， 同时利用内 源蛋白酶体降解途径， 诱导c ‑Myc/Max二聚体降解， 实现抑制活性与诱导降解的双功能， 在 体内体外抑制TNBC增殖， 为TNBC的治疗提供新的策略。 发明内容 [0007]本发明的目的是为了解决背景技术中提及的c ‑Myc小分子抑制剂的特异性差， 毒 性高的问题， 提供一种基于非天然核酸适体的PROTAC的制备方法及其在三阴性乳 腺癌治疗说　明　书 1/6 页 3 CN 115475252 A 3