(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210858313.5 (22)申请日 2022.07.20 (71)申请人 中山大学 地址 510275 广东省广州市海珠区新港西 路135号 (72)发明人 梅林　王莹　余永康　 (74)专利代理 机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 专利代理师 赵崇杨 (51)Int.Cl. C12N 15/867(2006.01) C12N 15/65(2006.01) C12N 15/12(2006.01) C12N 5/10(2006.01) A61K 35/15(2015.01)A61P 35/00(2006.01) A61K 47/46(2006.01) (54)发明名称 一种基因编辑工程化M1型巨噬细胞外泌体 的制备方法及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种基因编辑工程化M1型巨 噬细胞外泌体及其制备方法与应用。 本发明利用 外泌体参与细胞间的通讯及OX40/OX40L通路在 机体免疫激活中的重要作用， 获得过表达OX40L 蛋白的工程化M1型巨噬细胞外泌体； 该外泌体能 重新编程M2型巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞， 其 效果比原始的M1型巨噬细胞外泌体更加显著； 能 激活CD8+T细胞， 其分泌的IFN ‑γ一方面可以杀 伤肿瘤细胞， 另一方面可以作用于肿瘤相关巨噬 细胞， 从而实现适应性免疫和先天免疫的协同抗 肿瘤作用， 从而显著抑制肿瘤的生长、 有效地延 长小鼠的生存期。 同时， 工程化M1型巨噬细胞外 泌体的体内生物安全性好， 参与细胞间的通信， 调节机体的免疫。 权利要求书1页 说明书5页 附图4页 CN 115261410 A 2022.11.01 CN 115261410 A 1.一种基因编辑工程化M1型巨噬细胞外泌体的制备方法， 其特征在于， 具体包括以下 步骤： S1、 使用编码 OX40L蛋白的慢病毒溶液感染巨噬细胞， 筛选， 得到稳定表达OX40L的工程 化巨噬细胞； S2、 将步骤S1得到的稳定表达OX40L的工程化巨噬细胞诱导其定向极化为工程化M1型 巨噬细胞； S3、 将步骤S2得到的工程化M1型巨噬细 胞置于培养基中， 收集上清， 离心， 收集沉淀， 洗 涤， 即得工程 化M1型巨噬细胞外泌体。 2.根据权利要求1所述方法， 其特 征在于， 步骤S1中采用的慢病毒溶 液MOI为5～20。 3.根据权利要求1所述方法， 其特 征在于， 步骤S1中采用的巨噬细胞为RAW  264.7细胞。 4.根据权利要求1所述方法， 其特征在于， 步骤S1中所述筛选为添加嘌呤霉素进行筛 选， 嘌呤霉素浓度为2 ～5 μg/mL。 5.根据权利要求1所述方法， 其特征在于， 步骤S2中定向极化采用含有100～500ng/mL   LPS的完全培 养基进行培 养。 6.根据权利要求1所述方法， 其特征在于， 步骤S3 中培养基采用去外泌体血清配制的完 全培养基培养。 7.一种基因编辑工程化M1型巨噬细胞外泌体， 其特征在于， 由权利要求1～6任一所述 方法制备 得到。 8.权利要求7所述基因编辑工程化M1型巨噬细胞外泌体在作为免疫药物载体中的应 用。 9.权利要求7所述基因编 辑工程化M1型巨噬细胞外泌体在制备肿瘤免疫治疗药物中的 应用。 10.一种肿瘤免疫治疗药物， 其特征在于， 含权利要求7所示工程化M1型巨噬细胞外泌 体。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115261410 A 2一种基因编辑 工程化M1型巨噬细胞外泌体的制备方 法及其 应用 技术领域 [0001]本发明属于生物医药技术领域。 更具体地， 涉及一种基因编辑工程化M1型巨噬细 胞外泌体的制备 方法及其应用。 背景技术 [0002]近年来以CAR ‑T为代表的细胞疗法和以PD1/PD ‑L1阻断剂为代表的抗体疗法在肿 瘤的免疫治疗中取得了突出 的进展。 然而， 除了适应性免疫之外， 先天免疫也同样重要。 据 报道在肿瘤组织中有接近一半是巨噬细胞， 以巨噬细胞为代表的先天免疫的作用不容忽 视， 尤其是这些巨噬细胞往 往是促进癌症发生发展的M2型肿瘤相关巨噬细胞。 [0003]外泌体作为细胞分泌的胞外囊泡， 参与细胞间的通信。 其中M1型巨噬细胞外泌体 具有重编程肿瘤相关巨噬细胞为M1型巨噬细胞的能力， 恢复巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤， 从而增强机体的先天免疫。 除了固有的生物效应之外， 由于其独特的特性和优势， 外泌体被 认为是天然的药物载体， 被广泛研究用于各类药物的递送。 如中国专利公开了一种M1型巨 噬细胞外泌体疫苗及其制备方法和 应用， 使M1型巨噬细胞摄取特定的肿瘤抗原Ag， 然后提 取携带肿瘤抗原Ag的M1型巨噬细胞的外泌体， 即得到外泌体疫苗M1Ag ‑Exos。 但现有技术公 开的M1型巨噬细胞外泌体是携带了特定的肿瘤抗原Ag制备得到， 但使用肿瘤特异 性抗原其 表达量较低， 免疫原 性非常弱， 难以诱发机体产生有效的抗肿瘤免疫应答， 同时机体对其存 在先天性免疫耐受， 同样也不能有效激发机体免疫应答。 此外， 免疫细胞或分子可能使某些 肿瘤抗原表 位减少或丢失， 从而 逃逸免疫系统识别和杀伤。 如现有技术 公开了外源性OX40L 基因修饰的巨噬细胞能促进其对肿瘤抗原提呈， 增强淋巴细胞对肿瘤抗原的特异性应答， 提高CTL的杀伤活性。 由于细胞具有功能多样性， 巨噬细胞也分为很多种不同功能和作用的 细胞， 而OX40L基因是否也能作用与其他巨噬细胞。 目前有关于OX40L基因与M1型巨噬细胞 的作用于机理还未见报道， 也并未用于肿瘤 免疫的研究中， 为了开发一种能够参与细胞间 的通讯， 并与机体免疫激活相关作用同的递送体系， 能够调节T细胞和M1型巨噬细胞， 在保 证稳定性和安全性的前提下， 参与细胞间的通信， 调节机体的免疫， 用于肿瘤的免疫治疗， 为癌症的免疫 治疗提供一种新的见解。 发明内容 [0004]本发明要解决的技术问题是克服上述问题的缺陷和不足， 提供一种基因编辑工程 化M1型巨噬细胞外泌体的制备 方法及其应用。 [0005]本发明的第一个目的是提供一种基因编辑工程化M1型巨噬细胞外泌体的制 备方 法。 [0006]本发明的第二个目的是提供一种基因编辑工程 化M1型巨噬细胞外泌体。 [0007]本发明的第三目的是提供 所述工程 化M1型巨噬细胞外泌体的应用。 [0008]本发明上述目的通过以下技 术方案实现：说　明　书 1/5 页 3 CN 115261410 A 3