(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210994459.2 (22)申请日 2022.08.18 (71)申请人 南京中医药大学 地址 210023 江苏省南京市栖霞区仙林大 道138号 (72)发明人 林炜　赵明　路楚洁　魏勇军　 杜瑞　林兆柱　陈培英　 (74)专利代理 机构 上海申沪专利代理有限公司 31483 专利代理师 张洪敏 (51)Int.Cl. C12P 17/06(2006.01) C12N 15/81(2006.01) C12N 15/54(2006.01) A61K 31/352(2006.01)A61P 35/00(2006.01) A61P 31/10(2006.01) A61P 33/06(2006.01) C12R 1/865(2006.01) (54)发明名称 一种怀特酮、 异怀特酮的生物合成方法 (57)摘要 本发明公开了一种利用合成生物学技术在 酿酒酵母体内异源合成怀特酮和异怀特酮的方 法， 本发明以异戊烯基转移酶SfG6DT和LaPT1分 别作为怀特酮和异怀特酮的表达元件， 在酿酒酵 母细胞工厂中构建基因表达模块获取活性化合 物怀特酮和异怀特酮。 本发明合成方法经济高 效、 绿色环保， 合成得到的怀特酮、 异怀特酮纯度 高， 具有重要的应用价 值。 权利要求书2页 说明书5页 附图2页 CN 115232843 A 2022.10.25 CN 115232843 A 1.怀特酮的生物合成方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 构建酵母菌株DR ‑01： 使用醋酸锂高效转化法将基因模块表达盒XII ‑1up‑pPGK1‑ SfG6DT‑tCPS1‑XII‑1down和pMEL10 ‑XII‑1重组质粒转化到酿酒酵母菌株IM X581中， 将转化 产物涂布在含有亮氨酸、 色氨酸、 组氨酸的YNB培养基的平板上， 30℃培养3 ‑5天， 待长出单 菌落后， 提取酿酒酵母基因组测序， 将此菌株命名为DR ‑01； 以染料木素和二甲基烯丙基焦 磷酸在该酵母菌株DR ‑01中异源表达的异戊烯基转移酶SfG6DT作用下获得化合物1—怀特 酮， 分子式C20H18O5， 结构式如下： 2.根据权利要求1所述的一种怀特酮的生物合成方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 酵母菌株DR ‑01中， 染料木素和二甲基烯丙基焦磷酸DMAPP在异戊烯基转移酶SfG6DT的 催化下生成怀特酮 酶反应体系为： 1M/L的Tris ‑HCl， 10mg/mL底物染料木素， 20mM/L的二甲基烯丙基焦磷 酸， 1M/L的MgCl2， 10mM/L的还原型辅酶 Ⅱ， 异戊烯基转移酶SfG6DT160 μL， 超纯水， 混匀； 于 25～30℃水浴锅中反应过夜后， 用乙酸乙酯萃取， 合并萃 取液后离心浓缩至干， 后加甲醇复 溶， 经0.2 2 μm微孔滤膜滤 过， 得怀特酮。 3.根据权利要求2所述的一种怀特酮的生物合成方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 酵母菌株DR ‑01中， 染料木素和二甲基烯丙基焦磷酸在异戊烯基转移酶SfG6DT的催化 下生成怀特酮 300 μL酶反应体系 为： 1M/L的Tris ‑HCl60 μL， 10mg/mL底物染料木素1.7μL， 20mM/L的二 甲基烯丙基焦磷酸9μL， 1M/L的MgCl23μL， 10mM/L的还原型辅酶 Ⅱ60μL， 异戊烯基转移酶 SfG6DT160 μL， 超纯水补至300 μL， 混匀； 于30℃水浴锅中反应过 夜后， 用500 μL乙酸乙酯萃取 三次， 合并萃取 液后离心浓 缩至干， 后加甲醇复溶， 经0.2 2 μm微孔滤膜滤 过， 得怀特酮。 4.一种异怀特酮的生物合成方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 构建酵母菌株DR ‑02： 使用醋酸锂高效转化法将基因模块表达盒XII ‑1up‑pTDH3‑ LaPT1‑tSPO1‑XII‑1down和pMEL10 ‑XII‑1重组质粒转化到酿酒酵母菌株IMX581中， 将转化 产物涂布在含有亮氨酸、 色氨酸、 组氨酸的YNB培养基的平板上， 30℃培养3 ‑5天， 待长出单 菌落后， 提取酿酒酵母基因组测序， 将此菌株命名为DR ‑02； 以染料木素和二甲基烯丙基焦 磷酸在该酵母菌株DR ‑02中异源表达的异戊烯基转移酶LaPT1作用下获得化合物2—异怀特权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115232843 A 2酮， 分子式C20H18O5， 结构式如下： 5.根据权利要求 4所述的一种异怀特酮的生物合成方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 酵母菌株DR ‑02中， 染料木素和二甲基烯丙基焦磷酸在异戊烯基转移酶L aPT1的催化下 生成异怀特酮 酶反应体系为： 1M/L的二流苏糖醇， 1M/L的3 ‑吗啉丙磺酸， 10mg/mL底物染料木素， 20mM/L的二甲基烯丙基焦磷酸， 1M/L的MgCl2， 10mM/L的还原型辅酶 Ⅱ， 异戊烯基转移酶 LaPT1微粒体， 超纯水， 混匀； 于25～30℃水浴锅中反应过夜后， 用乙酸乙酯萃取， 合并萃取 液后离心浓 缩至干， 后加甲醇复溶， 经0.2 2 μm微孔滤膜滤 过， 得异怀特酮。 6.根据权利要求5所述的一种异怀特酮的生物合成方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 酵母菌株DR ‑02中， 染料木素和二甲基烯丙基焦磷酸在异戊烯基转移酶L aPT1的催化下 生成异怀特酮 300 μL酶反应体系为： 1M/L的二流苏糖醇0.3 μL， 1M/L的3 ‑吗啉丙磺酸7.5 μL， 10mg/mL底 物染料木素1.7μL， 20mM/L的DMAPP9μL， 1M/L的MgCl23μL， 10mM/L的还原型辅酶 Ⅱ60μL， LaPT1微粒体210 μL， 超纯水补至300 μL， 混匀； 于30℃水浴锅中反应过夜后， 用500 μL乙酸乙 酯萃取三次， 合并萃取液后离心浓缩至干， 后加甲醇复溶， 经0.22 μm微孔滤膜滤过， 得异怀 特酮。 7.权利要求1～3任一项制备 得到的怀特酮在制备抗癌药物及抗真菌剂中的应用。 8.权利要求 4～6制备 得到的异怀特酮在制备抗真菌剂及抗疟原虫剂中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115232843 A 3