(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211250460.0 (22)申请日 2022.10.12 (71)申请人 北京奇迈 永华生物科技有限公司 地址 100176 北京市大兴区经济技 术开发 区经海四路25号院2号楼1单元4层401 室 (72)发明人 芦志华　刘永峰　 (74)专利代理 机构 北京预立 生科知识产权代理 有限公司 1 1736 专利代理师 朱萍 (51)Int.Cl. C12N 5/0783(2010.01) A61K 35/17(2015.01) A61P 7/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01)A61P 37/02(2006.01) (54)发明名称 一种无血清高效培 养人NK细胞的方法 (57)摘要 本发明公开了一种无血清高效培养人NK细 胞的方法， 所述方法无外源血清无自体血清使 用， 只使用细胞因子和化合物， 能够高效激活扩 增NK细胞， 适合规模化细胞制剂的生产和临床应 用， 此外， 所述方法培养过程中不依赖于饲养细 胞， 提高了使用安全性， 避免了回输后由于体内 和体外环境的差异对NK细胞在体内的扩增和杀 伤活性的影响， 临床应用前 景广阔。 权利要求书2页 说明书9页 附图2页 CN 115478051 A 2022.12.16 CN 115478051 A 1.一种高效培养人NK细胞的无血清培养基， 其特征在于， 所述无血清培养基包括激活 培养基和扩增培 养基； 所述激活培养基为含有FB23、 IL ‑2、 IL‑7、 IL‑12、 IL‑15、 IL‑18、 IL‑21、 IFN‑γ、 PMA、 PHA 的H3无血清培养基； 所述扩增培 养基为含有I L‑2的H3无血清培养基。 2.根据权利要求1所述的无血清培养基， 其特征在于， 所述激活培养基中各组分的浓度 分别为FB23(0.5 ‑5)ng/mL， IL ‑2(10‑30)ng/mL， IL ‑7(0.5‑5)ng/mL， IL ‑12(0.5‑5)ng/mL， IL‑15(20‑80)ng/mL， IL ‑18(0.5‑5)ng/mL， IL ‑21(0.5‑5)ng/mL， IFN ‑γ(0.5‑5)ng/mL， PMA (0.1‑3)μg/mL， PHA(5 ‑20)ng/mL。 3.根据权利要求1所述的无血清培养基， 其特征在于， 所述扩增培养基 中IL‑2的浓度为 (30‑90)ng/mL。 4.根据权利要求2所述的无血清培养基， 其特征在于， 所述激活培养基中各组分的浓度 分别为FB23  2ng/mL， IL ‑2 20ng/mL， IL ‑7 2ng/mL， IL ‑12 2ng/mL， IL ‑15 50ng/mL， IL ‑18  2ng/mL， I L‑21 2ng/mL， IFN ‑γ2ng/mL， PMA  1 μg/mL， PHA  15ng/mL。 5.根据权利要求3所述的无血清培养基， 其特征在于， 所述扩增培养基 中IL‑2的浓度为 60ng/mL。 6.一种无血清高效培养人NK细胞的培养方法， 其特征在于， 所述培养方法包括如下步 骤： (1)Day‑1， 准备抗体孵育培养皿或者培养瓶使用包被配方在4℃条件下孵育12h， 得到 经包被的培 养皿或者培 养瓶； (2)Day 0， 将外周血进行分离， 得到PBM C细胞； (3)Day 1‑Day 5， 采用权利要求1 ‑5中任一项所述的激活培养基对步骤(2)中得到PBMC 细胞在步骤(1)中得到的经包被的培养皿或者培养瓶中进行培养， 培养条件为37℃、 5％ CO2； (4)Day 6‑Day 13， 采用权利要求1 ‑5中任一项所述 的扩增培养基对步骤(3)中所述 的 PBMC细胞进行培 养， 培养条件为37℃、 5％CO2； (5)Day 14‑Day 16， 收获NK细胞。 7.根据权利要求6所述的培养方法， 其特征在于， 步骤(1)中所述的包被配方为： CD3单 抗、 CD16单抗、 CD137 单抗、 CD52单抗、 P D‑1单抗、 Her ‑2单抗； 优选地， 包被配方中各组分的浓度分别为： CD3单抗(0.1 ‑1)mg/mL， CD16单抗(0.01 ‑ 0.5)mg/mL， CD137单抗(0.01 ‑0.1)mg/mL， CD52单抗(0.01 ‑0.3)mg/mL， PD ‑1单抗(0.01 ‑0.1) mg/mL， Her ‑2单抗(0.01 ‑0.1)mg/mL； 更优选地， 包被配方中各组分的浓度分别为： CD3单抗0.75mg/mL， CD16单抗0.2mg/mL， CD137单抗0.05mg/mL， CD52单抗0.02mg/mL， P D‑1单抗0.0 5mg/mL， Her ‑2单抗0.0 5mg/mL； 优选地， 步骤(2)中所述PBMC细胞的浓度为1.5 ×106细胞/mL， 培养72h后， 加入同等体积 的激活培养基， 第120h， 检测PBMC细胞数量， 加入所述激活培养基调整PBMC细胞密度为1 × 106细胞/mL； 优选地， 步骤(3)中在第168h调 整所述PBMC细胞的浓度为1 ×106细胞/mL， 之后每48h监 测PBMC细胞数， 如果PB MC细胞数大于2.5 ×106细胞/mL， 则加入所述扩增培养基调整PBMC细权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115478051 A 2胞密度至1 ×106细胞/mL。 8.一种NK细胞群体或其衍生物， 其特征在于， 所述NK细胞群体或其衍生物为采用权利 要求6所述的培 养方法培 养得到的； 优选地， 所述 NK细胞群 体或其衍生物CD3‑CD56+CD16+大于80％。 9.一种用于治疗和/或预防自身 免疫性疾病和/或血液系统疾病和/或实体瘤的药物 组 合物， 其特 征在于， 所述药物组合物包 含权利要求8所述的NK细胞群 体或其衍生物。 10.如下任一方面的应用， 其特 征在于， 所述应用包括： (1)权利要求1 ‑5中任一项所述的无 血清培养基在激活扩增获得NK细胞中的应用； (2)权利要求8所述的NK细胞群体或其衍生物在制备治疗和/或预防自身免疫性疾病 和/或血液系统疾病和/或实体瘤的药物中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115478051 A 3